Ce protocole est important car il est conçu pour répondre à des questions sur le corrélat de la fonction de structure de la valve pulmonaire murine, ce qui est généralement délicat en raison de son hétérogénéité inhérente. La fixation contrôlée et l’imagerie corrélative ont été utilisées pour capturer la structure sur plusieurs échelles de longueur. Les images locales à haute résolution peuvent ensuite être mappées à l’emplacement anatomique précis de la valve pulmonaire.
Le Dr Tai Yi, directeur de la microchirurgie au Centre de médecine régénérative de l’hôpital national pour enfants, fera la démonstration de la procédure. Commencez par autoclaver les outils nécessaires à la dissection de la souris, y compris les ciseaux fins, les microforceps, les pinces microvasculaires, les pinces d’application de pince, les porte-micro-aiguilles, les ciseaux à ressort et les rétracteurs. Après avoir euthanasié une souris adulte C57BL/6, placez-la en position couchée dorsale sur un plateau, fixez ses membres avec du ruban adhésif et effectuez la thoracotomie.
Exposez le cœur en enlevant tout excès de tissu adipeux et de fascia, puis retirez l’oreillette droite et perfuser le ventricule gauche avec une solution saline à température ambiante. Enlevez tout le cœur en coupant la veine cave supérieure, la veine cave inférieure, l’artère pulmonaire et l’aorte, et coupez environ deux millimètres au-dessus de la jonction ventriculo-auriculaire, qui servira de conduit pour la pressurisation. Retirez les ventricules gauche et droit pour exposer les chambres à la pression atmosphérique, en veillant à ce que la structure du tronc pulmonaire ne soit pas affectée par l’élimination des ventricules.
Tube de pressurisation anastomose avec l’artère pulmonaire, laissant environ un millimètre de distance entre la jonction sinotubulaire et l’extrémité du tube pour s’adapter aux grands mouvements des folioles et du tronc pulmonaire. Élever le réservoir à une pression physiologique analogue et le remplir avec la solution saline. Testez le système d’écoulement pour vous assurer qu’il n’y a pas de blocages ou de bulles d’air.
Fixez un robinet d’arrêt à la valve pulmonaire anastomosée et assurez-vous d’un débit adéquat à travers le tube en changeant le tractus d’écoulement. Une fois que le débit est suffisant, basculer le débit sortant vers la valve pulmonaire anastomosée et assurer la pressurisation du tronc pulmonaire identifié par distension du tronc. Après avoir confirmé la pressurisation du tronc pulmonaire, incorporer progressivement la solution fixatrice primaire jusqu’à ce que 25% de la capacité du réservoir de la solution saline soit purgée.
Placez une gaze imbibée de fixateur sur l’échantillon de tissu pour éviter le dessèchement. Perfuser le fixateur pendant trois heures, en remplissant le réservoir pour maintenir une pression constante. Après la perfusion, conservez la valve cardiaque dans la solution fixatrice à quatre degrés Celsius jusqu’à une utilisation pouvant aller jusqu’à une semaine.
Pour la coloration, laver l’échantillon de valve cardiaque fixe trois fois avec un tampon de cacodylate molaire froid de 0,15 pendant cinq minutes et immerger complètement la valve cardiaque dans une solution de ferrocyanure de potassium 1,5, de cacodylate molaire 0,15, de chlorure de calcium millimolaire et de tétroxyde d’osmium à 2% sur la glace pendant une heure. Lavez les échantillons avec de l’eau distillée double à température ambiante en les plaçant dans un tube pendant cinq minutes avec une légère agitation. Après trois autres lavages, placer l’échantillon dans une solution de thiocarbohydrazide filtrée à température ambiante.
Après 20 minutes, lavez l’échantillon trois fois avec de l’eau, comme démontré précédemment. Ensuite, placez l’échantillon dans du tétroxyde d’osmium à 2% à température ambiante. Après 30 minutes, lavez-le avec de l’eau trois fois pendant cinq minutes chacun et incubez l’échantillon dans de l’acétate d’uranyle à 1% pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Pendant ce temps, préparez une solution de nitrate de plomb. Le lendemain, effectuez l’étape de lavage trois fois comme démontré précédemment, puis incubez le tissu valvulaire cardiaque dans une solution d’aspartate de plomb à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Lavez les échantillons trois fois de plus, puis effectuez un traitement de déshydratation en série sur les tissus valvulaires cardiaques avec de l’éthanol 20, 50, 70 et 90% fraîchement préparé sur de la glace pendant cinq minutes chacun, suivi de deux traitements ultérieurs avec de l’éthanol à 100%.
Après la déshydratation, déplacez les tissus vers de l’acétone glacée, puis placez-la dans de l’acétone fraîche à température ambiante pendant 10 minutes. Pour l’intégration, faites le mélange de résine selon les spécifications du fabricant. Placer les tissus dans des traitements ultérieurs de 25 à 75, 50 à 50 et 75 à 25 résine à acétone mélange pendant deux heures chacun.
Enfin, placez les tissus dans 100% de résine pendant la nuit. Le lendemain, placez les tissus dans de la résine fraîche à 100%. Après deux heures, transférer les tissus dans une capsule d’incorporation, ajouter de la résine fraîche à 100% et la placer dans un four à 60 degrés Celsius pendant 48 heures pour durcir.
L’artère pulmonaire anastomosée excisée avant et après l’application de la pression hydrostatique est montrée ici. Le tronc pulmonaire se distend que les feuillets valvulaires pulmonaires sont dans une configuration fermée. La tomographie microcalculée a confirmé la confirmation de la valve pulmonaire.
Les folioles étaient fermées et l’anneau était circulaire tandis que divers degrés de pressurisation inadéquate de la valve pulmonaire par fixation ou effondrement artériel ont été observés. Le volume micro CT rendant des sections transversales virtuelles a été corrélé avec des images optiques pour confirmer la direction et l’emplacement du découpage. Des images SBF SEM à haute résolution ont été prises dans une région locale d’une notice lorsque le bloc d’échantillons se trouvait à l’emplacement et à l’orientation souhaités.
Les images corrélées entre le volume micro CT rendant la tranche virtuelle, les images SEM SBF basse résolution et haute résolution sont présentées ici. Dans la représentation 3D d’une région segmentée de la valve pulmonaire, des composants extracellulaires tels que les cellules endothéliales, les cellules interstitielles valvulaires et les fibres extracellulaires peuvent être identifiés. Lorsque vous essayez ce protocole, veuillez garder à l’esprit que la pressurisation est essentielle et garantira que le rendement soit aussi élevé que possible.
