هذا البروتوكول مهم لأنه مصمم للإجابة على الأسئلة حول ارتباط وظيفة الهيكل للصمام الرئوي المورين ، وهو أمر صعب بشكل عام بسبب عدم التجانس المتأصل فيه. تم استخدام التثبيت المراقب والتصوير المترابط لالتقاط الهيكل على نطاقات طول متعددة. ويمكن بعد ذلك تعيين الصور المحلية عالية الدقة مرة أخرى إلى الموقع التشريحي الدقيق على الصمام الرئوي.
إثبات الإجراء سيكون الدكتور تاي يي، مدير الجراحة المجهرية في مركز الطب التجديدي في مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني. ابدأ بالاستعباد التلقائي للأدوات اللازمة لتشريح الماوس ، بما في ذلك المقص الدقيق ، والقوة الدقيقة ، والمشابك الوعائية الدقيقة ، والملقط تطبيق المشبك ، وحاملي microneedle ، ومقص الربيع ، والمسحبات. بعد القتل الرحيم للكبار C57BL/6 الماوس، وضعه في موقف recumbent الظهرية على صينية، وتأمين أطرافه مع الشريط وإجراء استئصال الصدر.
فضح القلب عن طريق إزالة أي الأنسجة الدهنية الزائدة واللفافة، ثم إزالة الأذين الأيمن وثقب البطين الأيسر مع محلول ملحي درجة حرارة الغرفة. إزالة القلب بأكمله عن طريق قطع الوريد الأجوف متفوقة، الوريد الأجوف أدنى، الشريان الرئوي، والشريان الأورطي، وقطع ما يقرب من ملليمترين فوق تقاطع البطين، والتي سوف تكون بمثابة قناة للضغط. قم بإزالة البطينين الأيسر والأييم لتعريض الغرف للضغط الجوي، مع ضمان عدم تأثر بنية الجذع الرئوي بإزالة البطينين.
أنابيب الضغط Anastomose مع الشريان الرئوي، وترك مسافة ما يقرب من ملليمتر واحد بين تقاطع سينوتوبلار ونهاية الأنابيب لاستيعاب لحركات كبيرة من المنشورات والجذع الرئوي. رفع الخزان إلى ضغط فسيولوجي مماثل وملئه بالمحلول الملحي. اختبر نظام التدفق للتأكد من عدم وجود انسداد أو فقاعات هوائية.
إرفاق stopcock إلى الصمام الرئوي anastomosed وضمان تدفق كاف من خلال الأنابيب عن طريق تبديل المسالك تدفق. بمجرد أن يكون التدفق كافيا ، قم بتبديل التدفق إلى الصمام الرئوي المصاب بالانستماء وتأكد من الضغط على الجذع الرئوي الذي تم تحديده عن طريق تثبيط الجذع. بعد التأكد من الضغط على الجذع الرئوي ، قم بدمج محلول التثبيت الأساسي تدريجيا حتى يتم تطهير 25٪ من سعة الخزان للمحلول المالح.
ضع شاش مثبتا على عينة الأنسجة لمنع التجفيف. Perfuse المثبت لمدة ثلاث ساعات، وإعادة ملء الخزان للحفاظ على ضغط مستمر. بعد التشوه، قم بتخزين صمام القلب في المحلول المثبت عند أربع درجات مئوية حتى يتم استخدامه لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
للتلطيخ، اغسل عينة صمام القلب الثابت ثلاث مرات بحاجز كاكوديلات مولار بارد لمدة خمس دقائق وغمر صمام القلب بالكامل في محلول من 1.5 فيروكيانيد البوتاسيوم، و0.15 صبار الأضراس، وكلوريد الكالسيوم الميليمولار، و2٪ من بيروكسيد الأوسميوم على الجليد لمدة ساعة واحدة. غسل العينات مع درجة حرارة الغرفة مزدوجة الماء المقطر عن طريق وضعها في أنبوب لمدة خمس دقائق مع التحريض طفيف. بعد ثلاثة يغسل أكثر، ضع العينة في محلول thiocarbohydrazide تصفيتها في درجة حرارة الغرفة.
بعد 20 دقيقة، اغسل العينة ثلاث مرات بالماء كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، ضع العينة في tetroxide 2٪ osmium في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، اغسله بالماء ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما واحتضن العينة في خلات أورانيل 1٪ بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
وفي الوقت نفسه، وإعداد حل من نترات الرصاص. في اليوم التالي، قم بإجراء خطوة الغسيل ثلاث مرات كما هو موضح سابقا، ثم احتضن أنسجة صمام القلب في محلول الأسبارتات الرصاصي عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. غسل العينات ثلاث مرات أخرى، ثم إجراء علاج الجفاف المسلسل على أنسجة صمام القلب مع أعدت حديثا 20، 50، 70، و 90٪ الإيثانول على الجليد لمدة خمس دقائق لكل منهما، تليها اثنين من العلاجات اللاحقة مع الإيثانول 100٪.
بعد الجفاف، نقل الأنسجة إلى الأسيتون الباردة الجليد، ثم وضعه في الأسيتون الطازج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. لتضمين، وجعل خليط الراتنج وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. وضع الأنسجة في العلاجات اللاحقة من 25 إلى 75، 50 إلى 50 و 75 إلى 25 الراتنج إلى خليط الأسيتون لمدة ساعتين لكل منهما.
وأخيرا، ضع الأنسجة في راتنج 100٪بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، ضع الأنسجة في راتنج 100٪ الطازجة. بعد ساعتين، نقل الأنسجة إلى كبسولة تضمين، إضافة الراتنج الطازجة 100٪ووضعه في فرن 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لعلاج.
يظهر الشريان الرئوي المقتطع قبل وبعد تطبيق الضغط الهيدروستاتيكي هنا. ينتفض الجذع الرئوي بشكل شعاعي مما يشير إلى أن منشورات الصمام الرئوي في تكوين مغلق. أكدت التصوير المقطعي المجهري تأكيد الصمام الرئوي.
وأغلقت المنشورات وكانت الأنولوس دائرية بينما لوحظت درجات متفاوتة من الضغط غير الكافي على الصمام الرئوي إما عن طريق التثبيت أو انهيار الشرايين. وكان حجم التصوير المقطعي الجزئي الذي يجعل المقاطع العرضية الافتراضية مرتبطا بالصور البصرية لتأكيد اتجاه التقطيع وموقعه. تم التقاط صور SBF SEM عالية الدقة في منطقة محلية داخل منشور عندما كانت كتلة العينة في الموقع والتوجه المطلوبين.
تظهر هنا الصور المترابطة بين وحدة التخزين المقطعية الصغرى التي تعرض الشريحة الظاهرية والصور منخفضة الدقة وصور SBF SEM عالية الدقة. في التمثيل ثلاثي الأبعاد لمنطقة مجزأة من الصمام الرئوي ، يمكن تحديد المكونات خارج الخلية مثل الخلايا البطانية والخلايا الخلالية الصمامية والألياف خارج الخلية. عند محاولة هذا البروتوكول، يرجى أن نضع في اعتبارنا أن أداء الضغط أمر بالغ الأهمية، وسوف تضمن العائد لتكون أعلى مستوى ممكن.
