Les images de microscopie des coraux des marais contiennent chromatique shift en trois dimensions. Cela nuit à l’analyse de colocalisation des images haute résolution. Il est généralement difficile d’enlever chromatique décalage provenait d’un échantillon biologique lui-même, notre méthode peut corriger le changement chromatique dans un échantillon biologique en utilisant des images de référence acquises séparément.
Takako Koujin, technicien de mon groupe, démontrera la procédure. Commencez par ensemencer 2,5 fois 10 à la cinquième cellule guérisseuse sur un plat de fond en verre de 35 millimètres et de les cultiver dans un incubateur de dioxyde de carbone. Après 24 heures d’incubation, remplacer le milieu par deux millilitres de formaldéhyde de 3,7 % dans le PBS et mélanger délicatement.
Fixez les ventes pendant 15 minutes à température ambiante sur une plate-forme rotative. Laver les cellules trois fois avec deux millilitres de PBS pendant cinq à dix minutes. Perméabilizez-les avec deux millilitres de point 1%essayez les 100 prochains en PBS tout en tournant et répéter les lavages avec PBS.
Puis tacher les cellules à l’aide d’un protocole standard de coloration des anticorps tel que décrit dans le manuscrit du texte. Pour obtenir une image de référence de référence crosstalk pour la microscopie à champ large, ajouter deux millilitres de point cinq microgrammes par millilitre Dappy pour rester dans l’ADN. Laissez les cellules sur la plate-forme rotative pendant 30 minutes.
Remplacez ensuite la solution par 100 microlitres de support de montage Pour obtenir une image de référence de référence d’étalonnage biologique pour tout type de microscopie, y compris la microscopie confoccale et super résolution. Fixer les cellules comme décrit précédemment, et préparer la solution de stock d’un colorant fluorescent conjugué phalloidin en 1,5 millilitres de méthanol. Ajouter la phalloidine dans PBS à une dilution de un à 100 pour alexa étage 405 un à 1000 pour Alexa étage 488 et un à 200 pour Alexa étage 594.
Ajouter un millilitre de la solution aux cellules et les incuber pendant 30 minutes pendant la rotation. Lavez les cellules trois à cinq fois avec deux millilitres de PBS. Remplacez ensuite le PBS par 100 microlitres de support de montage.
Pour acquérir des images de fluorescence à l’aide d’une microscopie à large champ, placez l’échantillon cible sur le microscope dans le logiciel d’imagerie, ouvrez la fenêtre d’expérience de conception et d’exécuter, définissez l’étape Z appropriée et sélectionnez les canaux bleus, verts et rouges. Dans l’onglet Exécuter, ajouter le nom du fichier d’image et commencer l’imagerie. Pour acquérir des images de référence crosstalk pour mesurer les décalages chromatiques dans l’échantillon sélectionnez la lumière d’excitation uniquement pour Dappy et assurez-vous d’utiliser exactement la même position de scène et la même hauteur Z que pour l’échantillon cible.
Alternativement, utiliser une image de champ lumineux comme lieu de référence à l’échantillon cible sur le microscope à champ large et acquérir une image de fluorescence de la cible en canaux bleus, verts et rouges. Puis acquérir des images en champ lumineux de la cible en canaux bleus, verts et rouges à la même position de scène et en utilisant la même hauteur Z. Pour acquérir des images de fluorescence à l’aide d’une microscopie à super résolution, comme sim 3D placez l’échantillon cible sur le microscope et acquérez une image sim de fluorescence de la cible dans des canaux bleus, verts et rouges.
Ensuite, reconstruisez l’image super résolue. Placez ensuite la tache d’échantillon avec la phalloidine multicolore sur un microscope sim 3D. Et acquérir plusieurs images sim fluorescence que les images de référence d’étalonnage biologique à des positions de stade point, puis reconstruire les images super résolu.
Utilisez un navigateur Web pour télécharger la dernière version binaire de Chromagnon. Extraire le programme et mettre le fichier exécutable dans un endroit pratique. Faites glisser et déposer les fichiers de référence des références de champ droit crosstalk ou biologique à la boîte de référence ou cliquez sur les fichiers de référence pour ouvrir un dialogue de sélecteur de fichiers.
Si le programme demande l’installation d’un kit de développement Java, appuyez sur Oui et accédez à la page téléchargée. Téléchargez et installez ensuite le JDK pour le système d’exploitation selon les instructions. Faites glisser et laissez tomber les fichiers cibles des taches d’anticorps dans la boîte cible.
Choisissez un format d’image de sortie et spécifiez le suffixe pour le nom du fichier de sortie. Pour les images de référence crosstalk avec un rapport signal/bruit élevé. Choisissez la projection parmi la liste de choix de l’alignement local et utilisez une taille minimale de fenêtre de 60.
Pour un étalonnage biologique multiple, les images de référence vérifient l’option références moyennes et n’en choisissent aucune pour l’alignement local, puis cliquez sur exécuter toutes pour commencer les mesures. Pour vous assurer que la mesure a été effectuée correctement, faites glisser et déposez les images de référence dans la boîte de référence et la boîte cible. Exécutez ensuite le programme et vérifiez que les images sont parfaitement superposées.
Chromatic Shift Correction en microscopie à champ large peut être effectuée à l’aide d’une image de référence crosstalk. Cette image a été obtenue avec un microscope à champ large équipé d’une seule caméra. L’émission de fluorescence de Dappy a été utilisée comme référence pour corriger les canaux bleus, verts et rouges.
Après alignement avec Chromagnon, le décalage chromatique et l’image de référence ont été corrigés. Lorsque le paramètre d’alignement a été appliqué à l’image cible par Chromagnon, l’ADN et le pont d’anaphase, qui sont vus incorrectement à l’extérieur de l’enveloppe nucléaire avant que l’alignement n’apparaisse comme prévu à l’intérieur de l’enveloppe. Chromatic Shift Correction d’une image SIM 3D peut être effectuée à l’aide d’une image de référence d’étalonnage biologique.
Trois images sim 3D de cellules HeLa tachées de phalhoïdes conjuguées à des teintures bleues, vertes et rouges ont été averged et le décalage chromatique a été mesuré par Chromagnon. Après alignement, le décalage chromatique et l’image de référence ont été corrigés. Le paramètre d’alignement a été appliqué à une image cible.
La vue XZ affiche une position de canal incorrecte le long du Z et légèrement le long des directions X, qui a été corrigée après alignement. Pour de meilleures performances, il est important d’obtenir des images de référence dans les mêmes conditions et le timing qu’une image cible.
