Ce protocole est significatif car il décrit une méthode qui peut être utilisée pour séparer plusieurs signaux fluorescents dans un seul échantillon. Par rapport aux méthodes traditionnelles, la numérisation par excitation peut augmenter la vitesse de l’expérience et améliorer la sensibilité des données. En utilisant différentes sources d’éclairage telles qu’un laser supercontinuum, cette méthode peut s’appliquer aux systèmes de microscope confocal à balayage de disque ou de laser.
Lors de l’exécution des balayages d’excitation, de la microscopie d’imagerie spectrale, il est important de vérifier que le pic d’excitation de chaque étiquette fluorescente se produit à une longueur d’onde différente. Pour commencer, installez un microscope à fluorescence inversé et une caméra tel que décrit dans le protocole texte. Chargez ensuite l’échantillon sur la scène.
Dans le menu déroulant de la fenêtre principale du microbrasserie, sélectionnez 475 nanomètres pour l’affichage initial de l’échantillon. Puis double-cliquez sur la boîte à côté de l’exposition et entrez 100 pour définir le temps d’exposition à 100 millisecondes. Enfin, cliquez en direct pour voir l’échantillon.
Cliquez maintenant sur Auto. Le bouton de plage de visualisation d’intensité automatique pour apporter les valeurs minimales et maximales dans des plages visuelles significatives. Ensuite, utilisez les boutons de mise au point du microscope pour concentrer l’échantillon.
Une fois au point, ajustez la position de l’échantillon de sorte que son bord est au centre du champ de vision. Ensuite, peaufiner la mise au point. L’échantillon est au point lorsque les caractéristiques de bord de l’image semblent nettes.
Maintenant, ouvrez l’outil d’acquisition multidimensionnel. Dans le menu, cliquez sur le bouton de charge et choisissez un paramètre prédéfini contenant une plage de longueur d’onde appropriée pour l’acquisition spectrale. Une fois que les paramètres d’acquisition sont confirmés, déplacez-vous vers une région vierge de l’échantillon et cliquez sur acquérir pour recueillir une pile d’images spectrales contenant du fond et du bruit à utiliser pour la soustraction plus tard.
Ensuite, déplacez-vous sur l’échantillon pour trouver les régions les plus brillantes. Les échantillons sont susceptibles d’avoir une fluorescence plus intense loin du bord de l’échantillon. Une fois que la région la plus brillante est située, prenez une seule pile d’images.
Chargez l’image acquise dans l’image J et utilisez la fonction de mesure d’Image J pour confirmer qu’aucune longueur d’onde ne contient de pixels surexposés. Si un temps d’exposition réduit est nécessaire en raison de la surexposition, l’image d’arrière-plan doit également être reprise avec un nouveau temps d’exposition. Si l’une ou l’autre des images contenait la limite de détection vers le haut de la caméra, ajustez le temps d’exposition de l’analyse spectrale pour vous assurer que le signal maximal dans toute la plage spectrale ne dépasse pas la plage dynamique de la caméra.
Avec un temps d’exposition approprié maintenant déterminé, placez un échantillon non étiqueté sur la scène. Obtenez des données d’image spectrale à partir de l’échantillon non étiqueté pour déterminer s’il y a une autofluorésence sous-jacente. Ensuite, placez un échantillon mono-étiqueté sur la scène.
Obtenez des données d’image spectrale à partir de chacun des échantillons monobellisé à utiliser comme contrôles spectraux pour construire une bibliothèque spectrale. Effectuez l’analyse pour chaque échantillon de contrôle à l’aide d’un temps d’exposition identique de la plage de longueur d’onde et des paramètres de la caméra. Ensuite, placez une diapositive contenant l’échantillon expérimental sur le microscope.
Sélectionnez un champ de vision qui a correctement étiqueté les cellules et achetez les données d’image spectrale de l’échantillon à l’aide des paramètres d’acquisition déterminés. Corrigez les images à une réponse spectrale plate en soustrayant le spectre d’arrière-plan de l’image de l’échantillon et en multipliant l’image par le coefficient de correction. Ici, un script MATLAB est utilisé pour traiter rapidement les images.
Ensuite, générer la bibliothèque spectrale. Pour de meilleurs résultats, normalisez chaque membre final à la bande de longueur d’onde de la plus grande intensité en déterminant quelle bande de longueur d’onde a la valeur la plus intense et en divisant la mesure à chaque bande de longueur d’onde par cette valeur maximale. Enregistrez ensuite les données spectrales sous forme de fichier dat.
Une fois terminé, démixez les données d’image spectrale. L’étape de non-mélange générera une image d’abondance pour chaque étiquette fluorescente, où l’abondance est la quantité de signal fluorescent relatif dans l’image de l’étiquette prospective. Ensuite, ouvrez chaque image non mélangée pour inspecter visuellement la distribution de composants purs.
Comparez l’ampleur de l’image d’erreur à celles des images non mélangées. Si l’ampleur de l’image d’erreur est similaire aux images d’abondance non mélangées, les signaux dans les données d’image spectrale peuvent ne pas être comptabilisés avec précision. Enfin, vérifiez qu’il n’y a pas de structures résiduelles non identifiées en comparant l’image d’erreur aux images non mélangées.
Lorsqu’il est effectué correctement, le processus de démixage spectral permet la séparation d’une pile d’images spectrales en contributions respectives de chaque étiquette de fluorescence. Ici, une image spectrale non mélangée serti d’images individuelles mettant en évidence l’autofluorescence des cellules musculaires lisses des voies respiratoires, une sonde GCaMP et une étiquette mitochondriale. Il y a une erreur élevée associée aux régions nucléaires et périnucléaires des cellules, ce qui indique que les spectres mesurés de ces régions ne sont pas bien expliqués par les spectres de la bibliothèque spectrale.
Les spectres purs prélevés sur des cellules étiquetées qui sont également autofluorescentes contamineront probablement le profil spectral du composant pur. Ici, on peut voir la différence de démixage avec des spectres purs contaminés par l’autofluorescence, par rapport aux spectres purs corrigés après soustraction à l’échelle. L’acquisition appropriée de données est essentielle lors de l’imagerie d’échantillons sensibles, car ils ne peuvent survivre qu’à une seule séance d’imagerie, contrairement à l’arrière-plan et aux contrôles qui peuvent être réimaged.
Assurez-vous que les paramètres appropriés de matériel et d’acquisition sont prédéterminés autant que possible. Dans un autre temps, les vidéos créées à partir de données en accéléré acquises à l’aide de ce système peuvent être utilisées pour suivre les sources fluorescentes dans des endroits discrets au fil du temps, comme la localisation du deuxième signal messager. Faites attention lorsque vous utilisez de puissantes sources de lumière pour éviter l’exposition aux yeux.
En outre, assurez-vous de porter des gants appropriés lors de la manipulation des étiquettes biologiques.
