تحتوي صور المجهر المرجاني في الأهوار على التحول اللوني في ثلاثة أبعاد. وهذا يضعف تحليل الكولوكية للصور عالية الدقة. من الصعب عموما لإزالة التحول اللوني نشأت من عينة بيولوجية نفسها، ويمكن أن أسلوبنا تصحيح التحول لوني في عينة بيولوجية باستخدام الصور المرجعية المكتسبة بشكل منفصل.
إثبات الإجراء سيكون تاكاكو كوجين فني من مجموعتي. تبدأ بذر 2.5 مرات 10 إلى الخلايا المعالج الخامس على طبق قاع الزجاج 35 ملليمتر ونمائها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة من الحضانة استبدال المتوسطة مع مليلتر اثنين من 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني ومزيج بلطف.
قم بإصلاح المبيعات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على منصة دوارة. اغسل الخلايا ثلاث مرات بمليلترين من برنامج تلفزيوني لمدة خمس إلى عشر دقائق. Permeabilize لهم مع مليلترين من نقطة 1٪ محاولة 100 المقبل في برنامج تلفزيوني أثناء تدوير وتكرار يغسل مع برنامج تلفزيوني.
ثم وصمة عار الخلايا باستخدام جسم مضاد قياسي تلطيخ بروتوكول كما هو موضح في مخطوطة النص. للحصول على صورة مرجعية من مرجع التوك المتبادل للمجهر widefield، إضافة ملليلتر اثنين من نقطة خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر Dappy للبقاء في الحمض النووي. اترك الخلايا على المنصة الدوارة لمدة 30 دقيقة.
ثم استبدال الحل مع 100 ميكرولترات من تركيب المتوسطة للحصول على صورة مرجعية من مرجع المعايرة البيولوجية لأي نوع من المجهر، بما في ذلك المجهر confocal وميكروفون فائقة. إصلاح الخلايا كما هو موضح سابقا، وإعداد حل الأسهم صبغة الفلورسنت phalloidin مترافق في 1.5 ملليلتر من الميثانول. إضافة phalloidin في برنامج تلفزيوني في تخفيف من واحد إلى 100 لطابق اليكسا 405 واحد إلى 1000 للطابق اليكسا 488 وواحد إلى 200 للطابق اليكسا 594.
إضافة ملليلتر واحد من الحل للخلايا واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة أثناء الدورية. اغسل الخلايا ثلاث إلى خمس مرات بمليلترين من برنامج تلفزيوني. ثم استبدال برنامج تلفزيوني مع 100 ميكرولترات من المتوسط المتصاعدة.
للحصول على صور الفلوريسنس باستخدام المجهر widefield مكان العينة المستهدفة على المجهر في برنامج التصوير، وفتح تصميم وتشغيل نافذة التجربة، وتعيين الخطوة Z المناسبة واختيار القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر. في علامة التبويب تشغيل، أضف اسم ملف الصورة وابدأ التصوير. للحصول على الصور المرجعية عبر التوك من أجل قياس التحولات اللونية في العينة حدد ضوء الإثارة فقط لDappy وتأكد من استخدام نفس الموضع المرحلة بالضبط وارتفاع Z كما بالنسبة للعينة المستهدفة.
بدلا من ذلك، لاستخدام صورة حقل مشرق كمكان مرجعي للعينة المستهدفة على المجهر الميداني واسعة والحصول على صورة الفلورانس من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر. ثم الحصول على صور حقل مشرق من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر في موقف المرحلة نفسها بالضبط واستخدام نفس الارتفاع Z. للحصول على صور الفلوريسنس باستخدام المجهر فائق الدقة، مثل 3D Sim وضع العينة المستهدفة على المجهر والحصول على صورة sim الفلوريسنس من الهدف في قنوات الأزرق والأخضر والأحمر.
ثم إعادة بناء الصورة السوبر حلها. في المكان التالي بقعة عينة مع phalloidin متعددة الألوان على مجهر سيم 3D. والحصول على صور متعددة sim fluorescence كما الصور المرجعية المعايرة البيولوجية في مواقف مرحلة نقطة، ثم إعادة بناء الصور السوبر حلها.
استخدام متصفح الويب لتحميل أحدث إصدار ثنائي من Chromagnon. استخراج البرنامج ووضع الملف القابل للتنفيذ في مكان مناسب. سحب وإسقاط الملفات المرجعية إما من تقاطع حقل الحق أو مراجع المعايرة البيولوجية إلى مربع مرجع أو انقر فوق ملفات مرجعية لفتح مربع محدد ملف الحوار.
إذا طلب البرنامج تثبيت مجموعة أدوات تطوير Java، اضغط على نعم، وانتقل إلى الصفحة التي تم تنزيلها. ثم قم بتنزيل وتثبيت JDK لنظام التشغيل حسب التعليمات. سحب وإسقاط الملفات الهدف من تلطيخ الأجسام المضادة في المربع المستهدف.
اختر تنسيق صورة إخراج وحدد لاحقة اسم ملف الإخراج. بالنسبة للصور المرجعية عبر التوك مع نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء. اختر الإسقاط من قائمة الاختيار من محاذاة المحلية واستخدام الحد الأدنى لحجم النافذة 60.
للحصول على عدة صور مرجعية للمعايرة البيولوجية تحقق من خيار متوسط المراجع واختر لا شيء للمحاذاة المحلية ، ثم انقر فوق تشغيل الكل لبدء القياسات. للتأكد من أن القياس تم تنفيذه بشكل صحيح، اسحب الصور المرجعية وإفلاتها في المربع المرجعي ومربع الهدف. ثم قم بتشغيل البرنامج وتحقق من أن الصور متراكبة تماما.
يمكن إجراء تصحيح التحول اللوني في المجهر العريض باستخدام صورة مرجعية عبر التوك. تم الحصول على هذه الصورة مع مجهر widefield مجهزة كاميرا واحدة. واستُخدمت انبعاثات الفلوريسنس من Dappy كمرجع لتصحيح القنوات الزرقاء والأخضر والأحمر.
بعد المحاذاة مع Chromagnon تم تصحيح التحول اللوني والصورة المرجعية. عندما تم تطبيق معلمة المحاذاة على الصورة الهدف بواسطة Chromagnon الحمض النووي وجسر الphase، الذي ينظر إليه بشكل غير صحيح خارج المغلف النووي قبل أن تظهر المحاذاة كما هو متوقع داخل المغلف. يمكن إجراء تصحيح إزاحة لونية لصورة sim ثلاثية الأبعاد باستخدام صورة مرجعية للمعايرة البيولوجية.
ثلاث صور سيم 3D من خلايا هيلا ملطخة phalloidins مترافق إلى الأصباغ الزرقاء والخضراء والأحمر كانت averged وتم قياس التحول اللوني من قبل Chromagnon. بعد المحاذاة تم تصحيح التحول اللوني والصورة المرجعية. تم تطبيق معلمة المحاذاة على صورة الهدف.
تعرض طريقة العرض XZ موضع قناة غير صحيح على طول Z و قليلاً على طول الاتجاهات X، والتي تم تصحيحها بعد المحاذاة. للحصول على أفضل أداء من المهم الحصول على الصور المرجعية تحت نفس الظروف والتوقيت كصور الهدف.
