Notre protocole nous permet de quantifier solidement les chimiotaxis microbiens directement dans leur habitat. Ainsi, nous pouvons isoler les micro-organismes et mieux quantifier et comprendre le potentiel métabolique. L’essai in situ de chimiotaxis, ou ISCA en bref, est un dispositif flexible, convivial, et simple qui permet un nouvel aperçu des comportements microbiens et donc le rôle et la fonction des micro-organismes dans n’importe quel environnement qui a une phase liquide.
Estelle Clerc, qui est actuellement doctorante dans mon groupe de recherche, démontre la procédure de déploiement en laboratoire et sur le terrain. Avant de préparer le chimioattractant, filtrer le milieu à l’aide d’un filtre de 0,2 micromètre et autoclave la solution filtrée. Ensuite, préparez une solution 10 millimolaire de chimioattractant dans 1 millilitre du milieu stérile, et filtrez la solution chimioattractante avec un filtre à seringues de 0,2 micromètre pour éliminer les particules et les contaminants potentiels.
Ensuite, diluer la solution de stock de chimioattractant filtré en série, selon le protocole expérimental. Pour remplir un ISCA, fixez une aiguille de calibre 27 à une seringue de 1 millilitre et chargez une seringue pour chaque concentration du chimioattractant filtré. En tenant l’appareil avec le port orienté vers le haut, injectez lentement chaque concentration de la substance dans chacun des cinq puits d’une rangée de l’appareil jusqu’à ce qu’une petite gouttelette apparaisse au-dessus de chaque port.
Lorsque tous les puits ont été remplis, transférer 1,5 millilitre de la culture des bactéries marines ou d’eau douce d’intérêt dans 150 millilitres du milieu de culture bactérienne approprié. Ensuite, placez deux petits morceaux de ruban adhésif à double face sur la surface plane d’un plateau de capacité de 200 millilitres. Et fixez un ISCA sur chaque morceau de ruban adhésif.
À l’aide d’une pipette sérologique de 50 millilitres, remplissez lentement le plateau de déploiement avec la solution bactérienne. Et permettre aux bactéries de répondre à la chimioattractant d’intérêt pendant une heure. Pour terminer l’analyse, utilisez une nouvelle pipette de 50 millilitres pour retirer doucement le milieu du plateau ISCA.
Pour récupérer les échantillons, placez d’abord l’ISCA de sorte que le port soit orienté vers le bas. Ensuite, utilisez une seringue stérile de 1 millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 pour tirer la solution de chaque puits. Tirer les échantillons de chaque rangée de la même concentration en un seul tube.
Ensuite, analyser les échantillons par cytométrie d’écoulement pour déterminer le nombre de bactéries attirées par chaque concentration de chimioattractants. Pour préparer un ISCA pour le déploiement sur le terrain, d’abord, recueillir 5 millilitres d’eau par ISCA du côté du champ et filtrer l’eau à travers un filtre de seringue de 0,2 micromètre dans un tube conique de 50 millilitres. Passez l’eau filtrée de seringue à travers une cartouche de filtre hydrophile GP deux fois, la collecte du filtrate dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres, après chaque rinçage.
Filtrez ensuite l’eau à travers un filtre à seringues de 0,02 micromètre dans un nouveau tube de 50 millilitres. Utilisez des aliquots du filtrate pour résuser tous les chimioattractants d’intérêt aux concentrations désirées dans les tubes coniques individuels de 15 millilitres. Ensuite, utilisez des seringues de 10 millilitres pour filtrer les chimioattractants résuspendus à travers des filtres de seringue individuels de 0,2 micromètre dans des tubes stériles de centrifugeuse conique de 15 millilitres pour éliminer les particules indésirables ou les composés insolubles d’eau.
Pour le déploiement sur le terrain de l’ISCA, vissez chaque ISCA sur la pièce 9 de l’enceinte de l’appareil et fermez l’enceinte. Sceller l’enceinte avec du ruban adhésif et utiliser des cordons élastiques pour fixer l’enceinte à un bras de déploiement et à une structure humaine. Alternativement, l’enceinte peut être fixée avec un petit poids sur un substrat peu profond ou attachée à un filet dans l’océan Pélagique.
Submergez complètement l’enceinte pour commencer le remplissage, en tenant fermement l’enceinte pour éviter un mouvement excessif de l’eau à l’intérieur. Une fois que le niveau de l’eau a atteint le sommet de l’enceinte, assurez-vous qu’aucun air n’est emprisonné à l’intérieur. Lorsque l’enceinte est complètement pleine, sceller les trous du bas et du haut avec deux bouchons.
Ensuite, laissez l’ISCA en place pendant 1 à 3 heures. À la fin de la période d’échantillonnage, retirez l’enceinte de l’eau. Placez l’enceinte au-dessus d’un récipient pour évacuer l’eau et retirez soigneusement la partie supérieure du ruban adhésif des trous avant.
Une fois que la conduite d’eau est passée sous le dessus de l’ISCA, retirez la prise inférieure et égouttez le reste de l’eau. Pendant que les ISCA sont toujours fixés à l’enceinte, utilisez une pipette de 1 millilitre, ou une seringue de 1 millilitre, pour enlever soigneusement l’eau emprisonnée au-dessus de chaque ISCA et enlever les ISCA sans toucher la surface supérieure. Ensuite, utilisez un lingette jetable pour enlever tout liquide restant à la surface, et récupérer les échantillons comme démontré pour la récupération de l’échantillon de laboratoire.
Dans cette analyse in vitro représentative, 1 millimolar a été déterminé pour être la concentration optimale de déploiement de glutamine car il a induit une réponse chemotactic significative qui était 18 fois plus élevée que le contrôle filtré d’eau de mer. Des concentrations plus élevées et plus faibles de glutamine ont également induit une réponse chimoactique significative, mais plus faible. Dans cette analyse de déploiement sur le terrain, cinq répliques isca remplies de glutamine de 1 millimolaire ont été déployées pendant 1 heure sur un site côtier près de Sydney, en Australie.
Et l’ISCA rempli de glutamine a attiré près de trois fois plus de bactéries que les puits de contrôle remplis d’eau de mer filtrée. La chose la plus importante à retenir lors du déploiement de l’ISCA, à la fois en laboratoire et sur le terrain, est d’éviter de créer de forts flux de fluides qui empêcheront la chimiotaxie. Les échantillons dérivés de l’ISCA peuvent être utilisés pour identifier des organismes ou des gènes spécifiques, pour caractériser le potentiel génomique des organismes chimoactiques et pour isoler de façon ciblée des souches spécifiques sur les médias sélectifs.
