Die kollektive Zellmigration wird oft durch den Gradienten von Signalmolekülen gesteuert. In diesem Video zeigen wir, wie zelluläre Kräfte während der kollektiven Migration durch biochemischen Gradienten gesteuert quantifiziert werden können. Also integrieren wir den mikrofluidischen Chip mit Traktionsmikroskopie, dann verwenden wir den mikrofluidischen Chip, um biochemischen Gradienten zu erzeugen, und wir verwenden die Traktionsmikroskopie, um zelluläre Kraft zu messen.
Dr.Hwanseok Jang, ein Postgraduierter in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Bereiten Sie die PDMS-Lösung vor, indem Sie das Basiselastomer und das Härtungsmittel im Verhältnis zehn zu eins mischen. 15 Milliliter des Basiselastomers in ein 50-Milliliter-Konikonrohr geben und 1,5 Milliliter Aushärtungsmittel hinzufügen.
Bereiten Sie zwei dieser Rohre vor. Wirbeln Sie die PDMS-Mischung für fünf Minuten vor zentrifugieren bei 196 Zeit g für eine Minute, um Blasen zu entfernen. Um die PDMS-Schablone herzustellen, gießen Sie etwa einen Milliliter der PDMS-Mischung auf den Wafer und vermeiden Sie SU-8-gemusterte Bereiche, so dass das PDMS die Seite der SU-8-Säulen berührt, aber nicht die Oberseite des SU-8-Musters.
Den Wafer bei Raumtemperatur über 30 Minuten auf eine flache Oberfläche stellen und dann das PDMS im Trockenofen bei 80 Grad Celsius über zwei Stunden aushärten. Ziehen Sie das PDMS vorsichtig von DER SU-8-Form ab, schneiden Sie die dünne PDMS-Membran mit einem 14-Millimeter-Hohlstanz. Entfernen Sie den Staub auf der Oberfläche der PDMS-Stücke mit Klebeband, bevor Sie die PDMS-Schablonen autoklavieren.
Um PDMS-Mikrokanal herzustellen, gießen Sie etwa 30 Milliliter PDMS-Mischung über die SU-8-Form. 30 Minuten in einer Vakuumkammer abgasen und dann das PDMS im Trockenofen bei 80 Grad Celsius über zwei Stunden aushärten. Ziehen Sie das PDMS vorsichtig von der SU-8-Form ab und schneiden Sie das PDMS auf eine Größe von 24 Millimetern um 24 Millimeter.
Erstellen Sie in jedem PDMS-Block einen Auslass und drei Einlässe mit einem Ein-Millimeter-Biopsie-Punch. Herstellung und Silanisierung von Glasfolien, wie im Textprotokoll beschrieben. Bedecken Sie die kantige Oberfläche des Bodenglases mit 100 Mikrolitern der Bindesilanlösung.
Nachdem Sie das Glas für eine Stunde bei Raumtemperatur verlassen haben, spülen Sie das Glas dreimal mit entionisiertem Wasser ab. Dann lassen Sie das Glas bei Umgebungslufttemperatur oder durch Blasen von Druckluft trocknen. Bereiten Sie die Polyacrylamid-Gel-Lösung wie im Textprotokoll beschrieben vor.
Dann für 10 Mikroliter Mischgellösung auf den rechteckigen Mikrobrunnen geben und einen kreisförmigen Deckelschlupf darauf legen. Fixieren Sie die Montage von kundenspezifischem Glas, Gel-Lösung, und Abdeckung Schlupf auf der Abdeckung einer Sechs-Well-Platte mit Klebeband und kippen Sie es. Dann Zentrifuge für 10 Minuten bei 96 mal g, um fluoreszierende Partikel in die obere Schicht des Polyacrylamid-Gels zu bringen.
Entfernen Sie die Baugruppe aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf eine flache Oberfläche mit dem Abdeckschlupf nach unten. Nach 30 Minuten die Baugruppe umdrehen und in eine 35-Millimeter-Petrischale geben. Füllen Sie das Gericht mit zwei Milliliter entionisiertem Wasser.
Entfernen Sie mit Zangen vorsichtig den Deckelschlupf, indem Sie ihn zur Seite schieben. Um Kollagen auf dem Polyacrylamid-Gel zu kodieren, lösen Sie ein Milligramm pro Milliliter Sulfo-SANPAH in einem warmen 50 Millimolar HEPES Puffer auf. 200 Mikroliter der Lösung auf die Geloberfläche fallen lassen und 10 Minuten lang durch UV-Licht aktivieren.
Nach der UV-Aktivierung spülen Sie das Gel zweimal mit 0,1 Molaren-HEPES-Puffer und dann einmal mit PBS. Das Polyacrylamidgel mit Kollagenlösung bei vier Grad Celsius über Nacht kodieren. Am nächsten Tag das Gel dreimal mit PBS waschen.
Tauchen Sie die autoklavierte PDMS-Schablone in die F-127-Lösung ein. Halten Sie es in einem 37-Grad-Grad-Celsius-Inkubator für eine Stunde. Waschen Sie die PDMS-Schablone dreimal mit PBS und entfernen Sie Flüssigkeit aus der PDMS-Schablone und dem Polyacrylamid-Gel.
Legen Sie dann die PDMS-Schablone auf das Polyacrylamid-Gel und fügen Sie pbS der Schablone hinzu. Entfernen Sie Blasen in den Löchern der PDMS-Schablone, indem Sie sanft pipetieren. Nachdem Sie Blasen entfernt haben, löschen Sie die PBS von der Oberfläche der PDMS-Schablone.
Nun 200 Mikroliter der Zelllösung auf die PDMS-Schablone geben und das Gel für eine Stunde in einen Inkubator legen, damit sich die Zellen an das Polyacrylamid-Gel anheften. Waschen Sie nach der Inkubation die Zelllösung mit Zellkulturmedien vorsichtig ab und fügen Sie weitere Zellkulturmedien hinzu. Entfernen Sie die PDMS-Schablone, überprüfen Sie die Bildung von Zellinseln unter dem Mikroskop.
Als nächstes behandeln Sie die Oberfläche des PDMS-Mikrokanals 30 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma. Nach dem Entfernen von Flüssigkeit auf dem Polyacrylamid-Gel-gefüllten Bodenglas, legen Sie den PDMS Mikrokanal auf das Unterglas, und legen Sie die Baugruppe auf den benutzerdefinierten Glashalter. Füllen Sie den Mikrokanal mit zellkulturmedium.
Um die Einlassschläuche des integrierten mikrofluidischen Systems vorzubereiten, schließen Sie eine getrimmte Nadel und eine 30-Zentimeter-Mini-Volumenlinie mit einem Drei-Wege-Hahn an. Bereiten Sie drei dieser Vereinbarungen vor. Für Auslassschläuche eine getrimmte Nadel und eine 75-Zentimeter-Mini-Volumenlinie mit einem Drei-Wege-Hahn verbinden.
Füllen Sie die Schlauchleitungen mit dem Medium, das für eine Stunde vorgeheizt wurde. Bereiten Sie Reservoirs vor, indem Sie Kolben aus Spritzen entfernen und Einlassschläuche anschließen. Stecken Sie die Nadelanschlüsse jeder Schlauchleitung in die drei Einlässe und einen Auslass des mikrofluidischen Geräts.
Füllen Sie jedes Reservoir mit drei Millilitern frischen Mediums oder konditionierten Mediums. Für den Gradiententest füllen Sie das linke Einlassreservoir mit 20 Nanogramm pro Milliliter Hepatozytenwachstumsfaktor oder HGF im Zellkulturmedium. Zur Visualisierung des Konzentrationsgradienten fügen Sie dem linken Einlassreservoir 200 Mikrogramm pro Milliliter Fluoreszenzfarbstoff hinzu.
Schließen Sie die Auslassschlauchleitung an eine Spritzenpumpe an. Stellen Sie das integrierte mikrofluidische System auf die Bühne eines herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskops. Nehmen Sie Bilder alle 10 Minuten für bis zu 24 Stunden mit einem automatisierten Mikroskop in einem Inkubator untergebracht.
Nehmen Sie zu jedem Zeitpunkt eine Reihe von Bildern mit einer 4X-Objektivlinse in drei verschiedenen Kanälen auf, darunter ein Phasenbild zur Visualisierung der Zellmigration, ein grünes Fluoreszenzbild zur Visualisierung von im Gel eingebetteten Fluoreszenzperlen und ein rotes Fluoreszenzbild zur Visualisierung des Konzentrationsgradienten einer Chemikalie. Nach der Aufnahme von Zeitrafferbildern 0,25%Trypsin-EDTA-Lösung in Mikrokanäle einfließen, um Zellen vom Polyacrylamid-Gel zu lösen. Wenn Sie Zellen vollständig aus dem Gel entfernen, nehmen Sie ein grünes fluoreszierendes Bild, das als Referenzbild für die Traktionsmikroskopie verwendet werden soll.
Fahren Sie mit der Datenanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Zur Messung von Kontraktilkraft und interzellulärer Beanspruchung wurden Traktionsmikroskopie und Monolayer-Stressmikroskopie mit dem mikrofluidischen Kanal kombiniert. Die Karten wurden in Funkkoordination mit äußerer Traktion mit warmer Farbe und nach innen gerichteter Traktion mit kalter Farbe gezeichnet.
Zur Zeit Null zeigten alle Inseln ähnliche Traktionsverteilungen mit starker Zugkraft am Rand und Fluktuation innerhalb der Insel. Nach 10 Stunden Anwendung des HGF-Gradienten, während der Grad der Inselausdehnung in jeder Spalte unterschiedlich war, waren die Traktionsverteilungen weitgehend ähnlich wie zeitgleich Null. Die durchschnittliche Traktion änderte sich 10 Stunden lang nicht.
Bei der Berechnung der Monolayer-Spannung zeigte jedoch jede Spalte unterschiedliche Trends. Dort, wo die HGF-Konzentration niedrig war, wurde die durchschnittliche Spannung innerhalb der Inseln über einen Zeitraum von 10 Stunden um etwa 200 Pascal aufrechterhalten. Bei hoher HGF-Konzentration verringerte sich die durchschnittliche Spannung innerhalb der Inseln allmählich von 230 Pascal auf 100 Pascal über 10 Stunden, wie zuvor gezeigt.
Wo die HGF-Konzentration in der linken Hälfte hoch und in der rechten Hälfte der Insel niedrig war, wurde die durchschnittliche Spannung um 150 Pascal gehalten. Das Befüllen des mikrofluidischen Kanals muss schonend sein. Es ist wichtig, Blasen zu entfernen, die im Kanal gefangen sind, während gleichzeitig die Mikro-Elternzellinseln nicht gestört werden.
Mit diesem integrierten System kann man untersuchen, wie Zellkollektiv mechanisch auf verschiedene chemische Gradienten wie Chemo-Anziehen oder Wachstumsfaktoren reagiert. Diese Plattform wird uns helfen, die Mechanik der kollektiven Zellmigration unter chemischen Gradienten weiter zu erforschen, was der Schlüssel zum Verständnis von Regeneration, Krebsmetastasierung und Entwicklung ist.
