Ce protocole est l’une des premières démonstrations de l’application directe du bruit électrique aux neurones individuels dans les tranches de tissu. Afin d’observer les réponses neuronales aux stimuli électriques. Le principal avantage de cette technique est que nous sommes en mesure d’évaluer un ensemble spécifique de paramètres de stimulus sur les neurones individuels.
Cette technique permet d’optimiser les paramètres de stimulus pour cibler des types neuronaux fonctionnels particuliers. Cela a des implications pour le développement de meilleures thérapeutiques pour la dysfonctionnement de l’équilibre. Avant de commencer l’extraction du tronc cérébral, Equilibry s-ACSF avec CARPOGEN et refroidir la solution à moins 80 degrés Celsius pendant 25 minutes jusqu’à ce qu’une boue de glace se soit formée.
Après la solution a refroidi, utiliser un numéro 22 lame de rasoir arrondi pour faire une incision de la peau sagittale dans le crâne d’un trois à cinq semaines C-57 noir six souris et utiliser l’extrémité pointue d’une paire de ciseaux modèle standard pour faire une petite incision, à partir de la lambda, le long de la suture sagittale. À l’aide d’une paire de pierson von Jours à courbure peu profonde, réfléchissez soigneusement les os pariétals et exoccipitaux réparés, et baignez le cerveau dans le froid glacial s-ACSF. Ensuite, isoler le tronc cérébral du cerveau antérieur et de son enveloppe osseuse à l’aide d’une lame de rasoir droite numéro 11 pour abattre le sulcus exoccipital pariétal et à la negula caudale.
Montez le tronc cérébral isolé ventral et vers le bas sur le bloc trapézoïdien en polystyrène perviously coupé, et utilisez un morceau de papier de soie pour enlever tout excès de liquide autour du tissu disséqué. Utilisez de la colle cyanoacrylate pour fixer le bloc de polystyrène au stade de coupe avec le rostral et le bas du tronc cérébral ci-joint. Utilisez une vitesse avancée de 0,16 millimètre par seconde et une amplitude vibratoire de trois millimètres pour obtenir 200 tranches transversales de micromètre du MVN.
Ensuite, utilisez une pipette garnie de plastique pour transférer les tranches de tissu sur un disque de papier filtre incarbinginated ACSF à 25 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Pour l’électrophysiologie de pince de correction de cellules entières, tirez d’abord des micro pipettes avec une résistance finale qui s’variera de trois à cinq méga Oms une fois remplies d’une solution interne à base de potassium et placées dans le bain. Pour obtenir des enregistrements de pinces patch à cellules entières à partir de neurones individuels dans le MVN, transférer une seule tranche de tissu de la chambre d’incubation à la chambre d’enregistrement d’une mise en place électrophysiologique standard, et utiliser un fil de nylon sur un poids en forme de U pour fixer la tranche.
Imprènuez continuellement la chambre d’enregistrement avec de l’ACSF gazéifié à 25 degrés Celsius à un débit de trois millilitres par minute et remplissez une micro pipette avec une solution interne. Appliquez une petite quantité de pression positive à l’aide d’une pipette pour repousser les débris de la pointe de la pipette. À l’aide d’un objectif de puissance inférieure, localisez le MVN avant de passer à une puissance élevée pour localiser les neurones individuels dans le MVN.
Avant de percer le tissu avec la pipette, appliquez une petite quantité de pression positive pour repousser les débris de la pointe de la pipette, et utilisez le micro manipulateur pour déplacer la pipette vers le neurone sélectionné. Une petite fossette devrait se former sur la membrane neuronale. Relâchez la pression positive et appliquez une petite quantité de pression négative.
Une fois qu’un joint Om d’un giga a été atteint, appliquez une légère pression négative courte et forte sur le support de pipette à travers le port d’aspiration pour rompre la membrane et créer une configuration de cellule entière. Obtenez ensuite des enregistrements de pinces à courant à cellule entière selon les protocoles standard. Pour appliquer le bruit stochastique et sinusoïde aux neurones vestibulaires médiaux individuels de noyau, réglez la gamme des amplitudes de trois à 24 amplis de pico pour déterminer le seuil neuronal et le taux de tir et regroupez les intensités de stimulus plus élevées et inférieures pour déterminer le seuil sensoriel.
Ensuite, calculez le taux de tir moyen au cours de la période de 10 secondes, au cours de laquelle l’étape actuelle depolarisation sera injectée pour chaque niveau actuel individuel. Utilisez les valeurs moyennes du taux de tir pour générer un taux de tir par rapport à la parcelle actuelle. Effectuez ensuite une analyse linéaire de régression pour déterminer le gradient de la ligne la mieux adaptée pour déterminer le gain neuronal.
Ni le bruit sinusoïde ni le bruit stochastique ne modifient les taux de cuisson du basilic des neurones MVN par rapport au contrôle d’aucun enregistrement sonore. Dans cette expérience, le niveau de bruit sélectionné de 6 amplis pico est inférieur au seuil, car on peut observer que le taux de cuisson moyen commence à augmenter par rapport au seuil expérimental de 12 amplis pico. Ce seuil a été déterminé objectivement en groupant les niveaux de stimulus au-dessus et au-dessous du seuil expérimental.
Le gain neuronal a été évalué en soumettant les neurones à une suite d’étapes actuelles dépolarisantes de zéro à 50 amplis pico en 10 incréments d’ampli pico avec et sans bruit. En effet, le bruit sinusoïde et stochastique appliqué à des amplitudes sous-seuil de six amplis pico peut modifier le gain des neurones MVN. Les paramètres de stimulus établis peuvent être appliqués au nerf innovant les neurones individuels pour fournir un stimulus plus naturaliste.
