Notre méthode vise à générer des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Cette lignée de cellules souches de reporter de champ de coeur permet l’étude à haut débit des mécanismes sous-jacents à la maladie cardiaque congénitale, fournissant un système qui est aimable à la manipulation génétique et pharmacologique. Il y a plusieurs maladies cardiaques congénitales spécifiques à la chambre.
En récapitulant la cardiogenèse in vitro, ce protocole permet l’étude du mécanisme de la maladie et le développement de futures thérapies régénératives. Ce protocole peut fournir un aperçu de la façon dont les cellules progénitrices cardiaques de différentes chambres sont spécifiées pendant le développement cardiaque. Commencez par cultiver des cellules souches embryonnaires transgéniques de souris dans des flacons T25 recouverts de gélatine à 0,1 % dans 2i medium.
Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, rincer les cultures avec PBS et ajouter un millilitre de trypsine par flacon pour dissocier la culture en cellules individuelles à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Lorsque les cellules se sont détachées, neutraliser la réaction avec quatre millilitres 10 FBS dans DMEM et compter les cellules par une méthode appropriée. Diluer les cellules à environ trois fois 10 à cinq cellules par concentration moyenne fraîche, et de recueillir les cellules par centrifugation.
Ensuite, resuspendez la pastille en cinq millilitres de milieu frais de 2i pour les replaquer sur de nouveaux flacons T25 recouverts de gélatine de 0,1 %. Pour la génération de CPC à partir de sphéroïdes cardiaques, recueillir 2,5 fois 10 à six de la souris transgénique détachée échantillon embryonnaire de cellules souches par centrifugation, et de réutiliser les cellules en 25 millilitres de SFD moyen. Plaquez la suspension cellulaire dans une plaque stérile de 150 x 25 millimètres pour incubation à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.
À la fin de l’incubation, recueillir les sphéroïdes cardiaques dans un tube conique. Sédimenter les sphéroïdes par centrifugation pour faciliter l’isolement sélectif des sphéroïdes et éviter les cellules individuelles. Resuspendez les sphéroïdes en 25 millilitres de milieu SFD frais complété par un nanogramme par millilitre d’activine A et 1,5 nanogramme par millilitre de protéine morphogenétique osseuse quatre.
Replatez les sphéroïdes sur la même plaque de culture pour une incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, se souvenir de tous les sphéroïdes cardiaques par centrifugation. Resuspendez les corps embryoïdes différenciés en 25 millilitres de milieu SFD frais pour le placage dans un attachement ultra-bas, flacon carré de 75 centimètres dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures.
Pour l’isolement du CPC spécifique au champ cardiaque à l’aide de reporters fluorescents, recueillir les corps embryoïdes par centrifugation et dissocier les cultures 3D avec un millilitre de trypsine à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. À la fin de l’incubation, bien mélanger par pipetting pour dissocier les cellules et neutraliser la réaction avec quatre millilitres de 10%FBS dans DMEM. Passer le mélange sur une passoire de 70 micromètres pour enlever tout corps embryoïde non dissocié, et sédimenter les cellules filtrées par centrifugation.
Pour trier les CPC par leur expression de reporter fluorescent, réutilisez la pastille dans la solution FACS de 500 microlitres et filtrez les cellules à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres dans un tube à fond rond de polystyrène de cinq millilitres sur la glace. Triez ensuite les cellules pour isoler les cellules exprimant la DP et le GFP par FACS, en recueillant les cellules en un millilitre de FBS. Pour isoler les CPC de premier par rapport au deuxième champ cardiaque en fonction de leur expression cxcr4 de protéine de surface, résuspendez les cellules progénitrices cardiaques embryonnaires de cellules souches de souris simples exprimant la DP dans 300 microlitres de 10 %FBS dans PBS complétés par des anticorps anti-Cxcr4 conjugués à la fluorescence.
Après cinq minutes à température ambiante, laver les cellules trois fois en un à deux millilitres de PBS frais et froid par lavage. Après le dernier lavage, resuspendez les cellules dans 500 microlitres de solution FACS et filtrez les cellules à travers une passoire de 40 micromètres dans un tube à fond rond de cinq millilitres. Triez ensuite les cellules par leur expression Cxcr4, recueillant les populations cxcr4-positives et négatives dans des tubes individuels contenant un millilitre de FPS par tube sur la glace.
Pour re-culturer les cellules progénitrices cardiaques isolées du FACS, spécifiques au champ cardiaque, recueillez les cellules triées par centrifugation et réutilisez les granulés dans le milieu SFD. Puis semer environ trois fois 10 à quatre cellules par puits dans une plaque de 0,1% gélatine-enrobée, 384-puits. Si l’augmentation de la mort cellulaire est notée après le tri, ajouter un inhibiteur rock de 10 micromifuges à chaque puits.
Après deux jours de culture, des battements spontanés devraient être observés. Pour analyser la capacité des CPC plaqués à se différencier des cardiomyocytes, recueillir les cellules au jour 12 de différenciation avec la trypsine, comme démontré, pour isoler les cardiomyocytes simples et résuspendre les cellules dans 4% paraformaldéhyde. Après 30 minutes à température ambiante, recueillir les cellules fixes par centrifugation et laver la pastille dans PBS pour enlever l’excès fixatif.
Ensuite, resuspendez les cellules dans 10%FBS dans PBS, et coïncubez la moitié de l’échantillon cellulaire avec l’anticorps t anti-troponine de souris et utilisez l’autre moitié de l’échantillon comme un contrôle négatif. Après 30 minutes à température ambiante, laver les cellules deux fois dans pbs frais et resuspendre les échantillons dans 10%FBS plus PBS complété par un anticorps secondaire approprié. Après une autre incubation de 30 minutes à température ambiante, lavez les cellules deux fois en PBS frais par lavage et réutilisez les cellules dans 200 microlitres de PBS par tube pour analyse sur un cytomètre d’écoulement.
Après environ 132 heures de différenciation, les cellules progénitrices cardiaques Tbx1-RFP et Hcn4-GFP peuvent être détectées par microscopie par fluorescence. En général, les cellules GFP et RFP apparaissent approximativement à peu près au même moment, et les deux populations de cellules progénitrices continuent de se développer à proximité et généralement dans un modèle complémentaire. L’ajustement des concentrations d’activine A et de protéine morphogénétique osseuse quatre modifiera les pourcentages de cellules progénitrices cardiaques du premier au deuxième champ cardiaque.
De même, à l’aide d’une lignée embryonnaire de cellules souches embryonnaires de souris de journaliste de DP, après 132 heures de différenciation, les cellules progénitrices cardiaques RFP-positives apparaissent. Après immunostaining pour Cxcr4, RFP-positif, Cxcr4-positif, et RFP-positif, les cellules Cxcr4-négatives peuvent être isolées. L’immunostaining pour la troponine cardiaque T au jour 12 de la différenciation confirme que les premières cellules de champ de coeur se différencient principalement en myocytes.
De même, les cellules dérivées de cellules progénitrices cardiaques Cxcr4 positives à la DP donnent naissance à des cardiomyocytes à des pourcentages beaucoup plus élevés que les cellules progénitrices cardiaques positives simples Cxcr4. Parfois, les cellules souches embryonnaires de souris ne parviennent pas à se différencier efficacement et forment un très faible nombre de cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque. Le moment, la concentration et la cohérence de l’ajout des cytokines et le nombre de cellules sont essentiels pour une génération réussie de cellules progénitrices cardiaques propres à la chambre.
Après cette procédure, les chercheurs peuvent analyser les propriétés physiologiques des différentes populations de cellules progénitrices cardiaques afin d’obtenir un meilleur aperçu de leurs spécifications et de leur fonction.
