小鼠心脏场特定心脏祖细胞的体外生成

我们的方法旨在从小鼠胚胎干细胞中生成心脏场特异性心脏祖细胞。这个心脏场记者干细胞系允许对先天性心脏病背后的机制进行高通量研究，提供一个适合遗传和药理操作的系统。有几个腔腔特异性先天性心脏病。

通过回顾体外心电生成，该协议允许研究疾病机制和未来再生疗法的发展。该协议可以提供洞察如何指定不同腔室的心脏祖细胞在心脏发育期间。首先在0.1%的明胶涂层T25烧瓶中生长转基因小鼠胚胎干细胞。在2i介质中。

当细胞达到70至80%的汇合时，用PBS冲洗培养物，并每瓶加入一毫升的三辛，在37摄氏度下将培养物分离成单细胞3分钟。当细胞分离时，用四毫升10 FBS在DMEM中中和中和反应，用适当的方法计算细胞。将细胞稀释到每新鲜介质浓度约三倍十至五个细胞，通过离心收集细胞。

然后将颗粒重新用五毫升新鲜 2i 介质重新装到新的 0.1% 明胶涂层 T25 烧瓶上。对于来自心脏球状物的CPC生成，通过离心收集2.5倍10至6个分离的转基因小鼠胚胎干细胞样本，并在25毫升SFD培养的细胞中重新补充细胞。将细胞悬浮板板放入一个150至25毫米的无菌板中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育48小时。

在孵育结束时，将心脏球状体收集到锥形管中。通过离心沉淀球体，以方便球体的选择性分离，并避免单个细胞。在25毫升新鲜SFD介质中重新补充球体，每毫升活性素A1毫微克和骨形态遗传蛋白4的1.5毫微克。

将球体重新板回同一培养板，在细胞培养箱中24小时孵化。第二天，通过离心回忆所有的心脏球状体。将分化胚胎体重新用 25 毫升新鲜 SFD 培养基，在细胞培养培养箱中电镀在超低附着、75 厘米方形的烧瓶中，48 小时。

为了使用荧光报告器分离心脏场特异性CPC，通过离心收集胚胎体，并在37摄氏度下用一毫升的三丁蛋白分离3分钟。在孵化结束时，通过移液混合，分离细胞，并在DMEM中用四毫升10%FBS中和中和反应。将混合物通过70微米滤株，去除任何非分离胚胎体，并通过离心沉淀过滤细胞。

要通过荧光处理器表达式对CPC进行排序，在500微升法发剂ACCS溶液中重新暂停颗粒，并通过40微米细胞滤株将细胞过滤成冰上5毫升聚苯乙烯圆底管。然后对细胞进行排序，通过 FACS 分离 RFP 和 GFP 表达细胞，在 FBS 的一毫升中收集细胞。为了根据表面蛋白Cxcr4表达分离第一和第二心脏场CPC，在PBS中300微升10%FBS中重新增殖单小鼠胚胎干细胞RFP表达心脏祖细胞，并辅以荧光结合抗Cxcr4抗体。

在室温下五分钟后，每次洗涤一到两毫升新鲜、冷的 PBS 中，将细胞洗涤三次。上次洗涤后，将 500 微升的 FACS 溶液中的细胞重新暂停，并通过 40 微米滤株将细胞过滤成 5 毫升的圆底管。然后按其Cxcr4表达对细胞进行排序，将Cxcr4阳性和负量收集到每个管中含有一毫升FSP的单个管中。

要重新培养FACS分离、心脏场特异性心脏祖细胞，通过离心收集分的细胞，并在SFD介质中重新补充颗粒。然后在0.1%的明胶涂层、384井板中播种约3倍至4个细胞。如果在分拣后注意到细胞死亡增加，则在每个井中加入10微摩尔 ROCK抑制剂。

经过两天的文化，应观察自发的殴打。为了分析镀CPC分化心肌细胞的能力，如演示，在分化的第12天收集细胞，如所证明的，分离单个心肌细胞，并在4%的半成甲醛中重新暂停细胞。在室温下30分钟后，通过离心收集固定细胞，并在PBS中清洗颗粒，以去除多余的固定剂。

接下来，在PBS中重新暂停10%FBS中的细胞，用小鼠抗肌酸T抗体孵育一半的细胞样本，并使用样本的另一半作为阴性对照。在室温下30分钟后，用新鲜PBS清洗细胞两次，并在10%FBS加PBS中重新暂停样品，并辅以适当的二次抗体。在室温下再孵育30分钟后，每次洗涤用新鲜PBS清洗细胞两次，每管200微升PBS中重新给细胞，用于流式细胞仪分析。

经过约132小时的分化，Tbx1-RFP和Hcn4-GFP心脏祖细胞可以通过荧光显微镜检测。一般来说，GFP和RFP细胞大约在同一时间出现，而前细胞的两个种群继续近距离扩展，通常以互补模式生长。调整活性素 A 和骨形态遗传蛋白 4 的浓度将改变第一和第二心脏场心脏祖细胞的百分比。

同样，使用RFP记者小鼠胚胎干细胞系，经过132小时的分化，RFP阳性心脏祖细胞出现。在对Cxcr4进行免疫抑制后，可以分离RFP阳性、Cxcr4阳性和RFP阳性。分化第12天心脏肌蛋白T的免疫抑制证实，第一个心脏场细胞主要分化成肌细胞。

同样，与Cxcr4单阳性心脏祖细胞相比，来自RFP阳性、Cxcr4阴性心脏祖细胞的细胞产生心肌细胞的比例要高得多。有时，小鼠胚胎干细胞不能有效地区分，形成非常低的心肌特异性心脏祖细胞。细胞因子添加的时间、浓度和一致性以及细胞数量对于成功生成腔体特异性心脏祖细胞至关重要。

按照这个程序，研究人员可以分析不同人群的心脏祖细胞的生理特性，以进一步深入了解其规范和功能。