Cette méthode répond à un problème commun dans le domaine et fournit un flux de travail complet pour l’isolement rapide et la caractérisation des vésicules extracellulaires simples avec des marqueurs spécifiques d’intérêt. L’analyse du suivi des nanoparticules est une méthode semi-automatisée. Il utilise les propriétés de la diffusion de la lumière et du mouvement brownien pour analyser la répartition de la taille des vésicules extracellulaires.
Vera Schmidt, doctorante de notre laboratoire, démontrera la procédure. Pour isoler les vésicules extracellulaires, après avoir recueilli deux échantillons millilitres de sang entier humain dans des tubes sériques séparant, laissez les échantillons coaguler pendant 15 minutes à température ambiante avant de séparer les cellules du sérum par centrifugation. Transférer un millilitre de sérum de chaque échantillon dans des tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre pour la centrifugation afin d’enlever les plaquettes et transférer 100 microlitres du plasma pauvre en plaquettes vers de nouveaux tubes de réaction de 1,5 millilitre.
Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution de précipitation exosome au plasma et vortex les échantillons à fond. Après une incubation de 30 minutes sur la glace, recueillir les vésicules extracellulaires par centrifugation. La pastille apparaîtra comme une couleur beige ou blanche.
Aspirer le supernatant et centrifuger l’échantillon à nouveau. Ensuite, enlevez toutes les transes de liquide et réutilisez la pastille dans 100 microlitres de PBS. Pour tacher les membranes cellulaires des vésicules, ajouter 10 microlitres de la suspension EV à 50 microlitres de solution de colorant éthanol PKH67 fraîchement préparée et bien mélanger.
Après cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité, diluer 50 microlitres de la suspension de vésicule extracellulaire tachée avec 2,5 millilitres d’eau distillée dans un tube conique de 15 millilitres, avec un mélange complet. Pour étiqueter les vésicules avec des anticorps, diluer 10 à 20 microlitres de la suspension extracellulaire non tachée de vésicule avec 50 microlitres d’eau distillée dans un tube de réaction de 1,5 millilitre, avec mélange complet. Ajouter 2,5 à cinq microlitres de l’anticorps d’intérêt au tube de réaction, avec un mélange complet, pour une incubation de 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
Ensuite, transférez 50 microlitres des vésicules étiquetées dans un tube conique de 15 millilitres contenant le volume expérimental approprié d’eau distillée, avec un mélange complet, comme indiqué dans le tableau. Avant d’analyser les vésicules extracellulaires tachées ou étiquetées, déplacez d’abord le filtre de fluorescence dans la trajectoire optique du microscope et de la caméra, et démarrez le programme, en suivant les instructions sur l’écran pour une mise en œuvre automatisée. Sous l’onglet Vérification cellulaire, sélectionnez le numéro de cellule correct pour la mesure de la fluorescence et la position de référence pour l’optique, afin de confirmer que le laser et le microscope sont dans un foyer commun.
Utilisez une seringue pour rincer le canal cellulaire avec 10 millilitres d’eau distillée, en prenant soin que la cellule de mesure est exempte de bulles d’air et que les bulles d’air ne sont pas injectées dans le système. Ensuite, diluer 10 microlitres de particules de polystyrène de la taille de 200 nanomètres étiquetées fluorescence dans 990 microlitres d’eau distillée et ajouter 10 microlitres de cette suspension de particules dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres d’eau distillée. Ensuite, injectez 2,5 millilitres de la première solution de particules diluées dans le canal cellulaire et cliquez sur Optimize Focus pour régler la caméra.
Pour mesurer l’échantillon, rincer le canal cellulaire plusieurs fois avec 10 millilitres d’eau distillée et injecter la suspension vésicule extracellulaire tachée. À l’aide de la position de référence, ajustez les paramètres d’acquisition appropriés sous l’onglet Vérification cellulaire, comme indiqué dans le tableau. Pour identifier la plage de sensibilité optimale, cliquez sur Nombre de particules vs.
Sensibilité, pour afficher une courbe des particules mesurées par écran pour les différents niveaux de sensibilité. Pour le paramètre Obturateur, ajustez la période pendant que la caméra permet à la lumière de passer pendant un intervalle déterminé. Pour les paramètres postacquisition, sélectionnez une luminosité minimale de 20, une taille minimale de 20 nanomètres et une taille de mesure maximale de 500 nanomètres.
Notez le nombre de particules détectées dans le champ de vision de l’écran. La barre de diffusion doit être dans le vert à l’orange, 50 à 300 particules gamme. Cliquez sur Vérifiez la dérive des particules à zéro volts et ouvrez l’onglet Mesure.
Cliquez sur Exécuter l’acquisition vidéo et définir le nombre d’expériences à trois à cinq, et le délai entre les expériences à zéro minutes. Réglez le nombre de positions de sous-vol individuelles à 11 et le nombre de cycles de mesure à 10 à chaque position de mesure à laquelle les particules doivent être analysées. Ensuite, sélectionnez un dossier, créez un nouveau nom de fichier et cliquez sur Ok pour démarrer la mesure.
À la fin de l’analyse, ouvrez l’onglet Analyse pour examiner les résultats. Ensuite, vérifiez le nombre moyen de particules par position, le nombre total de particules tracées et la concentration de particules, la largeur de distribution des particules, et la valeur de la moyenne, et l’écart type. L’utilisation de perles fluorescentes pour l’ajustement et l’étalonnage de la mesure donne une sensibilité optimale de réglage de 85% En utilisant ces paramètres, la caméra affiche une image nette et les mesures répétées démontrent un écart-type faible.
La coloration avec un kit de liaison cellulaire qui comprend un lieneur de cellules fluorescentes qui incorpore un colorant fluorescent vert avec de longues queues aliphatiques dans les régions lipidiques de la membrane cellulaire, révèle une forte corrélation entre la sensibilité et le nombre de particules mesurées. L’anticorps de coloration de vésicule extracellulaire contre une protéine d’intérêt indique une distribution de particules de 220 à 1,145 nanomètres, avec une taille maximale de 541 nanomètres. Aucune vésicule extracellulaire n’est détectée après la coloration anticorps de l’eau sans vésicule de contrôle, jusqu’à une sensibilité proche de 100% Si la mesure est commencée lorsque la dérive est supérieure à 5 micromètres par seconde, les répétitions individuelles démontrent des déviations distinctes.
Il est important de noter que l’utilisation de l’isothiocyanate de fluorescéine comme fluorochrome entraîne des mesures inexactes et non reproductibles, car ce fluorophore est sujet à un photobleaching rapide. Ce protocole répond à la principale demande de nombreux chercheurs dans ce domaine pour une caractérisation rapide des vésicules extracellulaires uniques, à l’aide de marqueurs spécifiques. Malgré le fait que, au cours de la dernière décennie, les méthodes se sont considérablement améliorées, il n’existe pas encore de protocole normalisé pour l’analyse des vésicules extracellulaires simples.
Indépendamment des progrès futurs de la recherche sur la biologie des vésicules extracellulaires, cette méthode fournit un protocole rapide et fiable pour la caractérisation des vésicules extracellulaires simples à l’aide de marqueurs spécifiques. Étant donné que nos protocoles actuels n’impliquent pas de longs délais de traitement ou des étapes à forte intensité de main-d’œuvre, ils conviennent également à un débit élevé de l’échantillon.
