Diese Methode behebt ein häufiges Problem im Feld und bietet einen vollständigen Workflow für die schnelle Isolierung und Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel mit spezifischen Markern von Interesse. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse ist eine halbautomatische Methode. Es nutzt die Eigenschaften der Lichtstreuung und Brownian Bewegung, um die Größenverteilung von extrazellulären Vesikeln zu analysieren.
Demonstriert wird das Verfahren von Vera Schmidt, einer Doktorandin aus unserem Labor. Um die extrazellulären Vesikel zu isolieren, nachdem sie zwei Milliliter Proben menschlichen Vollbluts in Serum-trennende Schläuche gesammelt haben, lassen Sie die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur koagulieren, bevor sie die Zellen durch Zentrifugation vom Serum trennen. Übertragen Sie einen Milliliter Serum aus jeder Probe in einzelne 1,5 Milliliter Reaktionsröhrchen für die Zentrifugation, um die Thrombozyten zu entfernen, und übertragen Sie 100 Mikroliter des thrombozytenarmen Plasmas in neue 1,5-Milliliter-Reaktionsröhren.
Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter exosome Ausfälllösung in das Plasma und Wirbel die Proben gründlich. Nach einer 30-minütigen Inkubation auf Eis, sammeln Sie die extrazellulären Vesikel durch Zentrifugation. Das Pellet wird als Beige oder weiße Farbe angezeigt.
Aspirieren Sie den Überstand und zentrieren Sie die Probe wieder. Entfernen Sie dann alle Flüssigkeitstrancen und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter PBS wieder auf. Um die Zellmembranen der Vesikel zu färben, fügen Sie 10 Mikroliter der EV Suspension zu 50 Mikroliter frisch zubereiteter PKH67 Ethanolfarbstofflösung hinzu und mischen Sie sie gründlich.
Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln 50 Mikroliter der gebeizten extrazellulären Vesikelsuspension mit 2,5 Milliliter destilliertem Wasser in einem 15 Milliliter konischen Rohr mit gründlicher Vermischung verdünnen. Um die Vesikel mit Antikörpern zu kennzeichnen, verdünnen Sie 10 bis 20 Mikroliter der ungefärbten extrazellulären Vesikelsuspension mit 50 Mikroliter destilliertem Wasser in einem 1,5 Milliliter Reaktionsrohr, mit gründlicher Mischung. Fügen Sie 2,5 bis fünf Mikroliter des von Interesse sindden Antikörpers in das Reaktionsrohr, mit gründlicher Mischung, für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln hinzu.
Dann 50 Mikroliter der markierten Vesikel in ein 15 Milliliter konisches Rohr übertragen, das das entsprechende Versuchsvolumen von destilliertem Wasser enthält, mit gründlicher Mischung, wie in der Tabelle angegeben. Bevor Sie die gebeizten oder beschrifteten extrazellulären Vesikel analysieren, bewegen Sie zunächst den Fluoreszenzfilter in den optischen Pfad des Mikroskops und der Kamera, und starten Sie das Programm nach den Anweisungen auf dem Bildschirm für die automatisierte Implementierung. Wählen Sie unter der Registerkarte Zellprüfung die richtige Zellennummer für die Fluoreszenzmessung und die Referenzposition für die Optik aus, um zu bestätigen, dass Laser und Mikroskop in einem gemeinsamen Fokus stehen.
Verwenden Sie eine Spritze, um den Zellkanal mit 10 Milliliter n. Wasser zu spülen, wobei darauf geachtet wird, dass die Messzelle frei von Luftblasen ist und Luftblasen nicht in das System injiziert werden. Als nächstes 10 Mikroliter fluoreszenzbeschrifte Polystyrolpartikel in 990 Mikroliter destilliertem Wasser verdünnen und 10 Mikroliter dieser Partikelsuspension in eine 15-Milliliter-Röhre mit 10 Milliliter destilliertem Wasser geben. Dann injizieren Sie 2,5 Milliliter der ersten verdünnten Partikellösung in den Zellkanal und klicken Sie auf Fokus optimieren, um die Kamera anzupassen.
Um die Probe zu messen, spülen Sie den Zellkanal mehrmals mit 10 Milliliter destilliertem Wasser und injizieren Sie die gefärbte extrazelluläre Vesikelsuspension. Passen Sie anhand der Referenzposition die entsprechenden Erfassungsparameter unter der Registerkarte Zellenprüfung an, wie in der Tabelle angegeben. Um den optimalen Empfindlichkeitsbereich zu identifizieren, klicken Sie auf Anzahl der Partikel im Vergleich.
Empfindlichkeit, um eine Kurve der gemessenen Partikel pro Bildschirm für die verschiedenen Empfindlichkeitsstufen anzuzeigen. Passen Sie für den Shutter-Parameter den Zeitraum an, den die Kamera dem Licht für ein bestimmtes Intervall zulässt. Wählen Sie für die Nacherfassungsparameter eine Mindesthelligkeit von 20, eine Mindestgröße von 20 Nanometern und eine maximale Messgröße von 500 Nanometern aus.
Beachten Sie die Anzahl der erkannten Partikel im Sichtfeld der Anzeige. Der Streubalken sollte im grünen bis orangen Bereich von 50 bis 300 Partikeln liegen. Klicken Sie auf Partikeldrift bei Null Volt überprüfen und öffnen Sie die Registerkarte Messung.
Klicken Sie auf Videoaufnahme ausführen, und legen Sie die Anzahl der Experimente auf drei bis fünf und die Zeitverzögerung zwischen den Experimenten auf null Minuten fest. Legen Sie die Anzahl der einzelnen Teilvolumenpositionen auf 11 und die Anzahl der Messzyklen an jeder Messposition, an der die Partikel analysiert werden sollen, auf 10 fest. Wählen Sie dann einen Ordner aus, erstellen Sie einen neuen Dateinamen, und klicken Sie auf Okay, um die Messung zu starten.
Öffnen Sie am Ende der Analyse die Registerkarte Analyse, um die Ergebnisse zu überprüfen. Überprüfen Sie dann die durchschnittliche Anzahl der Partikel pro Position, die Gesamtzahl der verfolgten Partikel und die Partikelkonzentration, die Verteilungsbreite der Partikel und den Wert des Mittelwerts sowie die Standardabweichung. Die Verwendung von Leuchtstoffperlen zur Einstellung und Kalibrierung der Messung ergibt eine optimale Einstellempfindlichkeit von 85%Mit diesen Einstellungen zeigt die Kamera ein scharfes Bild an und wiederholte Messungen weisen eine geringe Standardabweichung auf.
Die Färbung mit einem Zelllinker-Kit, das einen fluoreszierenden Zelllinker enthält, der einen grünen Fluoreszenzfarbstoff mit langen, aliphatischen Schwänzen in Lipidregionen der Zellmembran enthält, zeigt eine starke Korrelation zwischen der Empfindlichkeit und der Anzahl der gemessenen Partikel. Extrazellulärer Vesikel-Färbungsantikörper gegen ein Protein von Interesse weist auf eine Partikelverteilung von 220 bis 1, 145 Nanometern mit einer maximalen Spitzengröße von 541 Nanometern hin. Nach der Antikörperfärbung von kontrollvesikelfreiem Wasser werden keine extrazellulären Vesikel nachgewiesen, bis zu einer Empfindlichkeit von nahezu 100%Wenn die Messung begonnen wird, wenn die Drift größer als 5 Mikrometer pro Sekunde ist, zeigen die einzelnen Wiederholungen deutliche Abweichungen.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung von Fluorescein isothiocyanat als Fluorchrom zu ungenauen und nicht reproduzierbaren Messungen führt, da dieses Fluorophor anfällig für schnelle Photobleicharbeiten ist. Dieses Protokoll geht auf die führende Forderung vieler Forscher in diesem Bereich nach einer schnellen Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel unter Verwendung spezifischer Marker ein. Trotz der Tatsache, dass sich die Methoden in den letzten zehn Jahren erheblich verbessert haben, gibt es noch kein standardisiertes Protokoll für die Analyse einzelner extrazellulärer Vesikel.
Ungeachtet des zukünftigen Fortschritts der Forschung in der extrazellulären Vesikelbiologie bietet diese Methode ein schnelles und zuverlässiges Protokoll zur Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel mit spezifischen Markern. Da unsere aktuellen Protokolle keine langen Bearbeitungszeiten oder arbeitsintensiven Schritte beinhalten, eignen sie sich auch für einen hohen Probendurchsatz.
