Comment quantifier la Fraction des protéines fluorescentes photoactivation en vrac et dans des cellules vivantes

Nous présentons ici un protocole qui implique des protéines photoactivables et fluorescentes génétiquement couplées spectralement distinctes. Ces règles internes permettent la quantification de la fraction PAFP qui est photo activée pour être fluorescente. Jusqu’à présent, aucune méthode n’a été disponible pour quantifier en vrac dans les cellules de vie combien de pafp exprimés sont photo activé à fluoresce. La quantification présentée de l’efficacité de la photo-activation est illustrée pour PA-GFP et PA Cherry dans les cellules vivantes, mais elle est en principe largement applicable et peut être utilisée pour n’importe quelle protéine fluorescente photoactivable dans n’importe quelle condition expérimentale. Chaque fois que vous travaillez avec des protéines fluorescentes génétiquement codées, la quantité absolue de protéines exprimées varie d’une cellule à l’autre et elle est inconnue. Pour normaliser l’expression entre les cellules, nous introduisons des règles internes de protéines fluorescentes génétiquement couplées spectralement distinctes. En coupant l’information génétique d’une protéine florescent photo-activateable à une distincte spectrale toujours sur les règles internes de protéine fluorescente sont créées qui seront toujours exprimées à une quantité totale inconnue mais dans une quantité relative connue fixe d’un à un. Pour commencer à construire les plasmides tels que décrits dans le protocole texte qui l’accompagne. En outre, la culture dans la ligne cellulaire standard dans son milieu de perspective en utilisant la version sans phénol rouge. Lorsqu’elles sont prêtes à commencer l’expérience, récoltez les cellules à l’aide de trypsine sans rouge phénol pour réduire la florescence de fond. Après la récolte, remplir une pipette de 2 ml avec la suspension cellulaire d’une culture cellulaire confluente cultivée dans un flacon de culture cellulaire T 12,5. Ajouter une goutte dans chaque chambre d’une glissière en verre de huit chambre. Incuber la diapositive dans des conditions normales de culture cellulaire pendant 24 heures. Ensuite, transfectez les cellules à l’aide de reagents commerciaux suivant le protocole des distributeurs. Transfect les cellules avec les chimères GFP Cherry, PA-GFP Cherry et GFPPA Cherry. Retournez ensuite les cellules à l’incubateur pour permettre l’expression des protéines, le pliage et la maturation. Après un total de 20 heures après transfection, transférer les cellules au stade d’un microscope florescent confocal équipé de la chambre environnementale humidifiée et chauffée préchauffée à 37