Reprogrammation directe de la lignée des fibroblastes aux cellules progénitrices érythroïdes. C’est une nouvelle méthode que nous avons développée dans notre laboratoire afin de mieux étudier les processus de régulation transcriptionnelle déterminant le destin des cellules érythroïdes. Le principal avantage avec l’utilisation de la reprogrammation de lignée directe pour étudier le développement est qu’il s’agit d’une technique très simple.
Ainsi, par rapport, par exemple, la perte d’études de fonction chez les souris KNOCKOUT, ici, nous pouvons très facilement manipuler le facteur, sur-exprimer à un certain moment, puis facilement obtenir suffisamment de matériel pour étudier les effets en aval tels que les modifications de la chromatine ou des changements d’expression génétique. Bien que cette méthode se concentre sur la reprogrammation des fibroblastes de queue de souris aux progéniteurs érythroïdes, elle peut également être appliquée à d’autres types de cellules fibroblastes, et à d’autres organismes, y compris les humains. Les implications de cette technique s’étendent à la médecine transfusionnelle en ce sens qu’elle ouvre la voie à la production de globules rouges in vitro.
Alban Johansson de mon groupe de recherche démontrera la procédure. Commencez par couvrir la surface des plats avec 0,1% de gélatine. Incubez-les à 37 degrés Celsius pendant environ 20 minutes.
Aspirer la solution de gélatine et laisser sécher la vaisselle. Utilisez des ciseaux pour couper à la base de la queue d’une souris euthanasié pour l’enlever. Placez la queue dans DPBS avec 2%FBS jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
Dans une hotte de culture tissulaire dans des conditions stériles, préparer une solution de trypsine diluée de 0,02% trypsine EDTA dans DPBS et ajouter 5 millilitres dans un plat non encolé de 10 centimètres. Dans une hotte de culture tissulaire, laver la queue dans suffisamment d’éthanol à 70 % dans un tube de 15 millilitres pour la couvrir, puis dans le DPBS. Placez la queue à plat dans un plat et utilisez des forceps pour la maintenir en place.
Utilisez un scalpel pour faire une incision sur la queue le long de son axe longitudinal de la base à la pointe. Utilisez une paire de forceps pour saisir la queue et la tenir verticalement et utiliser une deuxième paire pour saisir la peau à côté de l’incision à la base de la queue et la peler en arrière. Effectuez ceci des deux côtés de l’incision jusqu’à ce que la peau puisse être décollée en tirant vers le bas vers l’extrémité de la queue.
Maintenez la queue pelée avec des forceps sur le plat contenant la solution trypsine. Utilisez des ciseaux de dissection pour couper la queue en petits morceaux. Utilisez des ciseaux pour fragmenter ces morceaux dans la solution trypsine en morceaux encore plus petits, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Pour étancher la trypsine, ajouter deux volumes de FEX moyen, DMEM avec des suppléments et des antibiotiques. Recueillir le contenu entier du plat dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger le tube à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirer le supernatant et résusquer la pastille contenant les fragments de queue en 10 millilitres de milieu FEX frais. Transférer cette suspension dans un plat recouvert de gélatine. Incuber à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone à 5 % et 4 % en oxygène, en ajoutant un milieu FEX frais tous les deux jours.
Observez la culture après cinq à sept jours, au cours de laquelle les fragments de queue se sont fixés au fond du plat, et les fibroblastes s’éloignent d’eux. Une fois que des grappes de fibroblastes sont visibles, secouez doucement le plat pour déloger les morceaux de queue. Aspirer le milieu avec tous les fragments d’os, en laissant les fibroblastes attachés à la plaque.
Ajouter 10 millilitres de milieu FEX frais et culturer les fibroblastes jusqu’à ce qu’ils soient confluents. Pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination par les progéniteurs hématopoïétiques dans la culture fibroblaste, dissocier les cellules de la plaque à l’aide de trypsine EDTA tel que décrit dans le manuscrit. Ajouter moyen et recueillir les cellules, et ajouter des perles magnétiques avec des anticorps.
Utilisez un système de séparation magnétique pour éliminer les cellules exprimant des marqueurs hématopoïétiques. L’inclusion de cette étape est absolument vitale parce qu’elle élimine tous les PSCS qui pourraient être présents dans la culture et donc la probabilité de faux positifs le jour de l’analyse du FACS. Les cellules d’emballage rétroviral de graines à environ 25 000 cellules par centimètre carré sur un plat traité par culture tissulaire.
Incuber les cellules dans le DMEM à haute teneur en glucose à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain matin, retirer le milieu et ajouter la moitié du volume utilisé pour la culture pendant la nuit de DMEM sans additifs. Dans l’après-midi, vérifiez les cellules pour 70 à 80% confluence nécessaire pour la transfection.
Commencez la transfection en préparant un mélange de deux à un de six microgrammes du vecteur d’expression PMX et de trois microgrammes du vecteur d’aide contenant des gènes Gag, Pol et enveloppe pour chaque facteur de reprogrammation. Ensuite, pour chaque facteur de reprogrammation, ajouter 300 microlitres de DMEM à température ambiante dans un tube stérile de polystyrène. Ajouter ensuite délicatement 27 microlitres de réaccfection commerciale à température ambiante directement dans le milieu pour éviter tout contact avec la paroi du tube.
Ajouter le mélange de plasmides dans le réaccente de transfection contenant du tube. Vortex brièvement et incuber le mélange pendant 15 minutes à température ambiante. Vortex le mélange d’ADN réavant de transfection à nouveau.
Ajoutez-le dropwise aux cellules d’emballage rétroviraux de sorte qu’il soit uniformément réparti sur la culture et incuber à 37 degrés Celsius. 24 heures après la transfection, retirer le milieu et ajouter le DMEM avec 20%FBS et 100 unités par streptomycine de pénicilline millilitre. 48 heures après la transfection, recueillir le supernatant et le filtrer à travers un filtre à seringues de taille pore de 0,22 micromètre.
Commencez la transduction en ensemencer les fibroblastes de pointe de queue à 10 000 cellules par centimètre carré sur des plats pré-enduits de gélatine à 0,1% dans le milieu FEX. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Lors de l’exécution de cette étape, il est important d’ajouter les quatre supernatants rétroviraux à un ratio égal pour s’assurer que les quatre transgènes contribuent également au processus de reprogrammation.
Le lendemain, préparer un mélange de transduction en ajoutant d’abord un volume de supernatant viral pour chaque facteur de reprogrammation complété par quatre microgrammes par millilitre de réaccente d’infection rétrovirale à six volumes de moyenne FEX. Après cela, aspirer le milieu FEX de la culture fibroblaste et ajouter le mélange de transduction. Incuber la réaction de transduction pendant quatre heures à 37 degrés Celsius dans des conditions hypoxiques à 5% de dioxyde de carbone et 4% d’oxygène.
Après quatre heures, aspirer le mélange de transduction et ajouter le milieu de reprogrammation frais. Incuber à 37 degrés Celsius dans des conditions hypoxiques pendant huit jours, en ajoutant un milieu de reprogrammation frais tous les deux jours. Observez la reprogrammation réussie avec des grappes de cellules cédées détachées de la plaque.
Pour récolter les cellules reprogrammées du plat pour une analyse plus approfondie, pipette doucement de haut en bas, puis recueillir les cellules. Après une reprogrammation réussie des IPE, les cellules YFP-positives sont observables dès cinq jours après la transduction. Ils deviennent ronds, se soulèvent de la surface de la plaque, commencent à former des grappes, et affichent une morphologie érythroïde précurseur-like.
L’hémoglobinisation de certaines cellules est évidente par la coloration positive de benzidine. Une petite fraction exprime le marqueur de surface ter-119 spécifique à l’érythroïde. Au huitième jour, on peut voir de grands groupes positifs à la PJ.
Jour huit iPE ont un phénotype érythroïde plus différencié que le cinquième jour iPE. Ils sont significativement plus petits, ont accumulé plus d’hémoglobine, et montrent une expression accrue de TER-119. L’analyse de l’expression génétique par qPCR des IPE recueillies au huitième jour montre qu’ils ont presque arrêté l’expression des gènes fibroblastes et ont augmenté les gènes érythroïdes.
Après avoir effectué des analyses de formation de colonies BFU-e sur les cellules reprogrammées, les iPE du huitième jour forment deux types de colonies, nettement rouges et pas visiblement rouges. Alors que les cellules des colonies rouges présentaient une morphologie érythroblastique, les cellules des colonies non rouges ne l’ont pas fait. Environ un enfant sur cinq a formé des colonies rouges pendant qu’environ une colonies sur 10 000 s’est formée à partir du huitième jour.
L’efficacité de reprogrammation des fibroblastes de queue-pointe ou des TTF est influencée par le nombre de passage. Les FTT qui avaient été adoptés neuf fois ont montré une réduction spectaculaire de la capacité de produire des grappes d’IPE par rapport aux cellules qui avaient été passages trois fois. En outre, différentes conditions de culture peuvent affecter l’efficacité de la reprogrammation.
Les TTF transduced cultivés dans la normoxie sont beaucoup plus lents à reprogrammer et des faisceaux d’IEP sont observés après 10 jours au lieu de cinq à huit jours. À la suite de cette procédure, des méthodes telles que les analyses de formation de colonies, l’analyse qPCR et FACS peuvent être appliquées afin de déterminer l’état de différenciation cellulaire. Depuis son développement, cette technique ouvre la voie à des chercheurs dans le domaine de l’érythropoïèse dans la compréhension du passage entre les cellules érythroïdes primitives et définitives chez la souris et l’homme.
