Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire vasculaire, comme la surveillance de la dynamique de la croissance vasculaire de l’ingénieur et le remodelage pendant la culture à long terme. Le principal avantage de l’utilisation de la tomographie par cohérence optique, ou OCT, est qu’il s’agit d’une stratégie d’imagerie facilement disponible, en temps réel et non constructive pour caractériser les caractéristiques structurelles et le processus de remodelage des navires d’ingénierie. Shangmin Liu et Wentao Ma, techniciens de mon laboratoire, feront également la démonstration de la procédure.
Pour commencer cette procédure, fabriquez l’échafaudage PGA tel que décrit dans le protocole de texte Dip PGA échafaudages dans un hydroxyde de sodium mol-per-litre pendant une minute, pour ajuster la structure spaciale de la maille. Ensuite, tremper les échafaudages dans de l’eau de qualité tissulaire trois fois pendant deux minutes chacun. Chaque fois, tapoter doucement l’échafaudage avec un papier de soie.
Ensuite, séchez les échafaudages dans une hotte avec un ventilateur pendant une heure. Pour assembler le bioréacteur et la jonction y pour l’imagerie OCT, d’abord, tremper le bioréacteur cylindrique en verre auto-développé, échafaudages PGA, tube de silicone, tubes biocompatibles, connecteurs, barre de remue-remuer, et l’équipement pour l’assemblage dans un réservoir d’éthanol de 95 pour cent pendant deux heures. Tirez l’échafaudage PGA à travers les bras latéraux du bioréacteur relié à un côté avec un connecteur, ainsi que d’un autre côté avec la jonction y utilisée pour livrer le fil guide OCT.
Assembler un autre échafaudage pga dans le bioréacteur de la même manière. Adapter le polytétrafluoroéthylène aux lèvres bioréacteurs en le serrant avec des sutures 4-0. Remettre le bioréacteur dans le réservoir d’éthanol pendant une heure avant de le sécher toute la nuit dans une hotte avec le ventilateur.
Maintenant, isoler les cellules musculaires ombilicales humaines lisses des artères ombilicales humaines par des techniques d’explantation standard Dans la cause de sauver les cellules dans les échafaudages pga, éviter toute goutte de suspension cellulaire sur le fond du bioréacteur. En outre, couvrez le bioréacteur avec le couvercle de silicone-bouchon dès que possible après le siège cellulaire pour empêcher la contamination. Développer et maintenir les cellules dans le milieu de croissance musculaire lisse.
Ensemencer les cellules musculaires lisses de l’artère ombilicale humaine à une concentration de 5 millions de cellules par millilitre dans le milieu de culture ci-dessus sur les échafaudages pga. Après avoir placé une barre de monsieur dans le bioréacteur, couvrez-la du couvercle du bouchon en silicone qui a un tube d’alimentation et trois courts segments de tubes insérés pour l’échange de gaz. Fixez les filtres PTFE 0,22 micron à chaque tube de changement d’air et fixez un bouchon d’héparine au tube d’alimentation.
Ajustez la barre de remue-remuer à une vitesse de 13 tours par minute. Ensuite, assemblez le bioréacteur en verre, le couvercle du bouchon en silicone et l’échafaudage PGA dans le système culturel. Laissez les cellules adhérer pendant 45 minutes en appuyant sur le bioréacteur toutes les 15 minutes avec un support vers la gauche et vers la droite.
Maintenant, connectez la pompe LOO-OH-YEE, sac salin tamponné phosphate, et le conducteur avec les tubes biocompatibles afin de créer le système de profusion. Ouvrez le conducteur pour remplir les tubes de PBS. Placez le bioréacteur global dans un incubateur humidifié avec 5 pour cent de CO2 à 37 degrés Celsius.
Remplissez la chambre de culture de 450 millilitres du milieu culturel. Cultivez les échafaudages ensemencés sous culture statique pendant une semaine, en changeant le milieu de culture tous les trois à quatre jours en aspirant la moitié de l’ancien milieu à travers le tube d’alimentation et en remplissant le réacteur d’une quantité équivalente de milieu de culture frais. Pour préparer le système de profusion pour l’imagerie OCT, pompez les fluides dans le sac PBS pour les faire circuler à travers les tubes biocompatibles et retourner au sac.
Ouvrez la puissance du conducteur et réglez le réglage de la pompe avec une fréquence de 60 battements par minute et une pression systolique de sortie de 120 millimètres de mercure. Ajuster les paramètres mécaniques en fonction des besoins de la culture vasculaire d’ingénierie tissulaire. Cliquez sur le bouton exécuter pour faire fonctionner le système de profusion.
Fournir la simulation pulsatile fix aux navires pendant trois semaines en pressurisant itérativement les tubes biocompatibles après une semaine de culture statique. Utilisez une source de lumière pour assurer la résolution axianale de dix à vingt microns et la profondeur d’image d’un à deux millimètres pour identifier la structure des vaisseaux sanguins conçus par les tissus, ou TEVBs, sur la base du système d’imagerie intravasculaire oct domaine de fréquence. Allumez le commutateur d’alimentation et ouvrez le logiciel de capture d’image Connectez le cathéter d’imagerie à fibre optique au moteur d’entraînement et au contrôleur optique, avec la fonction de retraite automatique par cathéter.
Définissez les paramètres du taux d’acquisition d’image à dix images par seconde, avec une vitesse de retrait automatique de dix millimètres par seconde. Maintenant, fixez le cathéter d’imagerie à la jonction y par le bouchon d’héparine avec une aiguille de calibre 18. Placez le cathéter dans le tube de silicone et identifiez l’étanchéité de la structure du maillage PGA avant de charger l’échafaudage pga sur le bioréacteur.
Maintenant, placez le bout de cathéter au-dessus de la région d’intérêt. Ajustez le dispositif de retrait et vérifiez la qualité de l’image. Obtenez des images à un, quatre, sept, dix, 14, 17, 21 et 28 jours en culture pour chaque TEBV individuel.
Enregistrez ces images séquentiellement avec une observation en temps réel de la microstructure TEBV comprenant la morphologie de surface, la structure interne et la composition. Répétez la mesure trois fois pour obtenir une mesure fiable des navires d’ingénierie à chaque fois. Capturez une série d’images tout au long des tests à l’aide du logiciel de capture d’image.
Pour utiliser un logiciel d’analyse d’image pour mesurer l’épaisseur de la paroi des vaisseaux sanguins, sélectionnez d’abord l’image à analyser. Ensuite, cliquez sur l’outil de suivi pour identifier automatiquement le côté intérieur du vaisseau sanguin conçu par les tissus avec le logiciel et esquisser manuellement le côté externe. Un diagramme d’épaisseur apparaîtra à l’écran.
Répétez la mesure cinq fois pour obtenir une mesure fiable des constructions. Envisagez d’utiliser deux enquêteurs indépendants obligés d’obtenir des renseignements. Ouvrez le couvercle du bouchon en silicone placé sur le bioréacteur lorsque la culture est terminée, et jetez le milieu de culture.
Desserrer le polytétrafluoroéthylène des lèvres bioréacteurs et couper les tubes de silicone du côté extérieur du polytétrafluoroéthylène avec des ciseaux. Récoltez les TÉLÉVISEURS du bioréacteur et coupez-les en sections pour un examen de microscopie à balayage électronique. Retirez le tube de silicone de soutien, et fixez les sections avec le formaldéhyde de puissance de 4 pour cent.
Effectuez des taches histologiques de routine avec le rouge trichrome et sirious de Masson pour examiner la morphologie du collagène et de la PGA. Pour évaluer le contenu de la PGA et le composant de collagène, observez des échantillons histologiques avec des taches rouges sirious à travers un microscope polarisé. Les images oct sont comparées aux découvertes histopathologiques des TÉLÉVISEURS après quatre semaines de culture.
L’image OCT montre une microstructure compacte et des composants spécifiques par rapport à l’évaluation histologique. Le milieu culturel, le tube de silicone, le TEBV et le fragment pga sont visibles. La coloration trichrome de Masson démontre des fibres de collagène distribuées dans une certaine direction, ainsi que des restes pga dans la couche médiatique des navires d’ingénierie.
La coloration rouge Sirius révèle les restes de la PGA et un composant de collagène à l’aide d’un microscope polarisé. Les micrographes à balayage électronique des vaisseaux d’ingénierie démontrent une microstructure compacte. Pendant ce temps, cette modalité d’imagerie intraluminale adopte une surveillance non constructive et facile des TEBV, y compris le processus de remodelage et la morphologie visuelle in situ dans la culture de longue durée.
Comme indiqué ici, le remodelage se produit plus tôt et les changements morphologiques se manifestent plus évidemment dans le groupe dynamique par la comparaison de l’épaisseur tebv. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie des tissus vasculaires afin d’explorer les caractéristiques de la structure et le processus de remodelage à long terme des vaisseaux d’ingénierie. L’affichage clair des restes polymériques par microscopie polarisée combinée à la formation image d’OCT pourrait être utile pour évaluer la dégradation d’échafaudage.
