We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.

Toutes les expériences ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de la recherche de la KU Leuven et sont en stricte conformité avec la directive du Conseil Communautés européennes du 22 Septembre 2010 (2010/63 / UE) et à la législation belge (KB du 29 mai 2013). Tous les efforts possibles ont été faits pour minimiser la souffrance des animaux et de réduire le nombre d&#39;animaux. 1. traitement des animaux et anesthésiques <ol><li> Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale d&#39;un mélange de chlorhydrate de kétamine (75 mg / ml) et du chlorhydrate de médétomidine (1 mg / kg) dans une solution saline. </li><li> Vérifiez les réflexes en pinçant les doigts avec une pince à assurer la souris est complètement sous sédation. </li><li> Appliquer éthanol à 70% pour désinfecter les paupières et la région autour des yeux en utilisant un coton-tige. Vérifiez le réflexe de la paupière pour évaluer en outre le degré de sédation. </li></ol> 2 Retrait de l&#39;oeil <ol><li> Assurez-vous que l&#39;animal se trouve sur un plat, sec etsurface lisse. </li><li> Stériliser une pince avec une courbe, pointe dentelée (taille de la pointe préféré: 0,5 x 0,4 mm). </li><li> Appuyez doucement sur la commissure (coin de l&#39;œil) avec la pince jusqu&#39;à ce que le globe oculaire est déplacé de la prise et le nerf optique est accessible. </li><li> Guide de la pince derrière l&#39;œil. Appuyez et maintenez le nerf optique fermement, de préférence avec le début de la courbe et non la pointe de la pince. Cela aidera à soulever le globe de la prise et de serrer le nerf optique complet. </li><li> Effectuer des mouvements circulaires avec la main qui tient la pince dans la direction de la moindre résistance alors que la souris reste sur la surface plane. La souris se balancer le long de la surface en fonction de la direction du mouvement de la main. </li><li> Effectuer cette action lorsque la vitesse augmente progressivement jusqu&#39;à ce que le nerf optique est resserré en deux (généralement entre 7 à 15 mouvements circulaires, d&#39;environ un demi-tour à un tour par seconde). Par conséquent, le globe oculaire est détachésupprimée. </li></ol> Soins 3 post-opératoire <ol><li> En cas de saignement (rare), remplir l&#39;orbite avec une coaguler visqueux et agent hémostatique. </li><li> Inverser l&#39;anesthésie par injection de 1 mg / kg de chlorhydrate atipamezol dans du sérum physiologique par voie intrapéritonéale. </li><li> Administrer 1 mg / kg par voie intrapéritonéale de Meloxicam toutes les 24 heures pour soulager la douleur. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique à l&#39;oeil qui reste pour éviter la déshydratation de la cornée. </li><li> Soit l&#39;animal récupérer sur une plaque chauffante ou d&#39;envelopper l&#39;animal dans un matériau isolant dans une cage séparée de contrôler la température du corps. </li><li> Mesurer le poids de la souris chaque jour pendant au moins 2 jours. La perte de poids peut indiquer la souffrance et dans ce cas, poursuivre le traitement jusqu&#39;à ce que Meloxicam l&#39;animal est complètement rétabli. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+in+primate+visual+cortex+assessed+by+immunostaining+for+the+transcription+factor+Zif268.">Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268.</a> Visual Neuroscience. 12 (1), 35-50 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Pour effectuer une énucléation réussie selon notre méthode, les étapes les plus importantes à prendre en compte sont les suivants: 1) à l&#39;aide d&#39;une pince avec une pointe recourbée et dentelée de la taille appropriée; 2) effectuer la énucléation sur une surface lisse et sec; et 3) en accélérant progressivement les mouvements circulaires de la direction avec le moins de frottement. Pour un résultat efficace, il est essentiel d&#39;utiliser une pince appropriées caractérisées par une pointe recourbée et dentelée (taille de la pointe préféré: la souris: 0,5 x 0,4 mm; rat: 2.15 x 1.3 mm). La courbure permet un accès facile vers le nerf optique après déplacement globe oculaire et est nécessaire pour le placement correct des mains lors de l&#39;exécution des mouvements circulaires. Pointes lisses ne sont pas recommandés car ils n&#39;ont pas la poignée nécessaire lors de la tenue du nerf optique. Défaut de tenir le nerf optique correctement pendant les mouvements circulaires en résulte une rupture de l&#39;artère ophtalmique, pauvres détachement de l&#39;œil et donc une mauvaise reproductibilité.Par conséquent, il est conseillé de commencer par la pratique de cette technique sur des animaux euthanasiés pour l&#39;optimisation de la pince de manutention afin de garantir maximale bien-être animal, une fois l&#39;application de la méthode in vivo. Énucléation de l&#39;oeil a réussi récemment également été réalisée chez le rat dans notre laboratoire en utilisant la même technique, sauf pour faire tourner le corps de l&#39;animal et en maintenant manuellement la pince stationnaire. Une limitation de la technique est qu&#39;elle pourrait éventuellement endommager la rétine. Par conséquent, ce procédé est moins approprié pour la collecte de rétines pour effectuer 5 l&#39;histologie. De plus, notre méthode est limitée à poster âges d&#39;ouverture des yeux depuis le globe oculaire doit être déplacé de la prise sans enlever ou couper les paupières. énucléation des yeux chez les différentes espèces, y compris les rongeurs, est systématiquement effectuée en utilisant des méthodes alternatives, qui impliquent souvent l&#39;ablation des paupières et en coupant le nerf optique 18,23-25. Ces méthods ont tendance à être plus envahissantes et ont une courbe d&#39;apprentissage plus élevé que la technique décrite ici. Sans la nécessité d&#39;enlever ou suturer les paupières, le temps de récupération post-opératoire est réduite, ce qui entraîne plus de bien-être animal et des résultats plus reproductibles.

Retrait d&#39;un œil et ainsi autodestruction de manière irréversible la surface des récepteurs sensoriels (rétine), impose une perte considérable de l&#39;entrée sensorielle le long de la voie visuelle. Le modèle d&#39;énucléation dans le système visuel juvénile et adulte s&#39;est avéré être utile pour comprendre le développement, la plasticité et la fonction des divers centres visuels 4.1. Les conséquences moléculaires, cellulaires et physiologiques de cette privation sensorielle peuvent fournir des indications sur la façon dont le développement normal est régulée et comment établies circuits corticaux faire face et de changer leur structure et la fonction en réponse à une telle modification vaste expérience. Différentes méthodes de privation visuelle exister et ils ont tous leurs avantages spécifiques dans la recherche liée à la vision. Par exemple élevage sombre spécifiquement élimine visuellement entraînée activité mais il n&#39;affecte pas l&#39;activité de la rétine spontanée. Visua même, sutures couvercle ou pansements oculaires supprimer modelésl entrée sans perturber l&#39;activité spontanée mais ils permettent la pénétration de la lumière dispersée à travers les yeux fermés. Ces méthodes sont réversibles et ont été montré pour être utile dans la compréhension du rôle des motifs vision et à faible niveau de corrélation d&#39;entrées jumelles dans la sculpture circuits corticaux au cours du développement 6-8. Dans la recherche de glaucome, le modèle de l&#39;écrasement du nerf optique chez les animaux adultes a été largement utilisée car elle établit une perte progressive des apports des cellules ganglionnaires de la rétine qui constituent le nerf optique 9,10. D&#39;autre part, l&#39;énucléation, où l&#39;œil et donc la rétine est complètement et instantanément supprimée, est le choix approprié de privation lorsque l&#39;objectif est de supprimer de façon irréversible la vision à la fois spontanée et motifs à la fois. Il induit également une forte activité déséquilibre intra-oculaire qui peut améliorer le rapport signal sur bruit dans des études de cartographie d&#39;activité 11,12. Comparant les changements fonctionnels et structurels en réponse à l&#39;énucléation avec eose après privation par des méthodes drastiques moins tels que couvercle suture par exemple, pourrait également exposer de nouvelles perspectives sur le rôle de l&#39;activité rétinienne spontanée dans les deux types d&#39;homéostasie et de la plasticité synaptique. Énucléation déclenche une perte d&#39;influences trophiques dans les objectifs de la rétine directs. Par exemple, les niveaux de BDNF sont fortement régulés à la baisse dans le noyau latéral géniculé (LGN) et colliculus supérieur de rats adultes énucléés 13. Espèces réactives de l&#39;oxygène, qui fonctionnent comme des molécules messagères de médiation remodelage structurel, ont également été détectés dans les structures sous-corticales du rat adulte du système visuel 14. En outre, la microglie et l&#39;activation des astrocytes dans les différentes structures sous-corticales visuelles cibles chez la souris se produisent dans un laps de temps après l&#39;énucléation spécifique d&#39;une semaine 15. Ensemble, les résultats de la désafférentation optiques dans les différentes réponses corticales à l&#39;gliale, niveau structurel et moléculaire. En dépit de ces sous-corticaleeffets, il ne soulève pas nécessairement des effets au niveau cortical 16. Il convient de noter, la plasticité corticale intermodal, y compris les modifications dans d&#39;autres domaines sensoriels à côté du renforcement des intrants non visuelles vers le cortex visuel privé surviennent après deux monoculaire (ME) 3,4,17,18 et binoculaire (BE) 1,17 énucléation. En plus de contribuer à la neuroscience visuelle, énucléation comme un type de désafférentation peut être utilisé pour étudier l&#39;équilibre entre les neuroprotecteurs 19 et 20 à 22 propriétés de neurodégénératives du système nerveux central. Différentes procédures pour effectuer l&#39;énucléation sont déjà décrites dans la littérature. Certaines méthodes pour in vivo ME rats et les souris sont moins simple en raison de sectionnement inutile de muscles orbitaux et les tissus 23-25. Autres publications telles que Mahajan et al (2011) 5. Fournissent un protocole détaillé à l&#39;aide<html> dissection pour une collection à haut débit de yeux pour étudier les corrélations génotype-phénotype, probablement post-mortem. Pour leur but, la méthode est pratique et rapide. Cependant, ce procédé est moins approprié pour énucléation in vivo lorsque l&#39;on opte pour étudier la voie visuelle afférente suivant énucléation (dans les animaux vivants) plutôt que de l&#39;oeil lui-même. Dans un tel contexte, la survie post-énucléation est d&#39;une grande importance. En outre, un minimum de dommages vivo et la préservation du nerf optique et tissus de l&#39;orbite est favorable. Ici, nous présentons une méthode alternative d&#39;énucléation, plus semblable à celle décrite par Faguet et al (2008) 26, qui offre certaines propriétés avantageuses:. Qu&#39;il est associé à une récupération post-opératoire rapide et se caractérise par un seuil d&#39;apprentissage très faible pour les chercheurs. En général, différentes méthodes sont complémentaires en fonction de l&#39;objet de recherches ultérieures: la morphologie de l&#39;œil ou de la recherche de la voie visuelle. ve_content &quot;&gt; En somme, l&#39;énucléation peut être appliquée à partir de la recherche de vision vers enquêtes de plasticité homéostatique et inter-modal cerveau, des propriétés de réponse gliales, et la stabilité de l&#39;axone. Dans cet article, visualisé, nous démontrons une méthode réalisable et fiable pour in vivo l&#39;énucléation de l&#39;œil dans la souris.

<table><tbody><tr><td>Ketamine hydrochloride (Anesketin)</td><td>Dechra Veterinary Products (Eurovet)</td><td>BE-V136516</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine hydrochloride (Domitor)</td><td>Orion Corporation (Janssen Animal Health)</td><td>BE-V151742</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol hydrochloride (Antisedan)</td><td>Orion Corporation (Elanco Animal Health)</td><td>BE-V153352</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics (cefazolin, Kefzol)</td><td>Eurocept Pharmaceuticals</td><td>BE 106267</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment (Fucithalmic)</td><td>Leo Pharma nv-sa</td><td>BE 144654</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC31 Forceps - Serrated Curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td>For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps - curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-13</td><td>For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td></tr><tr><td>Hemostatic cotton wool</td><td>Qualiphar</td><td>N/A</td><td>Other hemostatic agents are equally suitable (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Viscostat, #649, Ultradent Products)</td></tr></tbody></table>

a highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening

Énucléation ou l&#39;ablation chirurgicale de l&#39;œil peuvent généralement être considérées comme un modèle pour nerf désafférentation. Il constitue un outil précieux pour étudier les différents aspects de visuel, intermodale et la plasticité du développement le long du système visuel des mammifères 1-4. Ici, nous démontrons une technique élégante et simple pour l&#39;élimination d&#39;un ou des deux yeux chez la souris, qui est validé chez la souris de 20 jours jusqu&#39;à l&#39;âge aux adultes. En bref, un désinfectés pince courbe est utilisée pour serrer le nerf optique derrière l&#39;œil. Par la suite, les mouvements circulaires sont réalisés à la constriction du nerf optique et enlever le globe oculaire. Les avantages de cette technique sont une reproductibilité élevée, peu ou pas de saignement, la récupération post-opératoire rapide et un seuil très bas de l&#39;apprentissage pour l&#39;expérimentateur. Par conséquent, un grand nombre d&#39;animaux peut être manipulée et traitée avec une quantité minimum d&#39;effort. La nature de la technique peut induire des dommages légers àla rétine au cours de la procédure. Cet effet secondaire rend cette méthode moins convenable par rapport à Mahajan et al. (2011) 5 si le but est de recueillir et d&#39;analyser le tissu rétinien. De plus, notre méthode est limitée à l&#39;ouverture post-oculaires âges (souris: P10 - 13) à compter depuis le globe oculaire doit être déplacé de la prise sans enlever les paupières. Le vivo technique d&#39;énucléation en décrit dans ce manuscrit a été récemment appliquée avec succès avec des modifications mineures chez le rat et semble utile d&#39;étudier la voie visuelle afférente de rongeurs en général.

La figure 1 illustre la suppression réussie de l&#39;oeil en utilisant le protocole décrit et se caractérise par l&#39;absence de saignement ou de tout dommage physique apparent pour le tissu orbitaire ou orbite de l&#39;oeil (figures 1A, 1B). En outre, l&#39;énucléation a une cornée lisse, la choroïde et disque optique, indicatif pour un monde complètement intacte (figure 1C). Depuis notre protocole comprend le serrage du nerf optique derrière l&#39;oeil et la rotation mécanique, le nerf optique de l&#39;oeil est retiré rétrécie à la base de la rétine (figure 1D). Effectuer les résultats de la procédure décrites dans un nerf optique épuré sans aucun dommage pour la zone entourant le cerveau (figure 1E). Énucléation monoculaire, en combinaison avec la cartographie de l&#39;activité (figure 2), permet de délimiter nettement les régions fonctionnelles ou oculaire spécifique entrée dans la visua controlatérall cortex de la souris 12,27 ou colonnes de dominance oculaire, même chez les mammifères d&#39;ordre supérieur comme les singes 28. Dans les expériences avec des souris, l&#39;élimination d&#39;un (ME) ou les deux yeux (BE) en combinaison avec une stimulation visuelle cible et la détection d&#39;ARNm ou de Zif268 pour c-Fos niveaux d&#39;expression de protéine a été appliqué à découvrir activation neuronale régionale dans le cortex visuel 12,27 . Contrairement aux témoins stimulés visuellement (Figure 2A), les souris ont montré une activité basale BE dans le cortex visuel du fait de l&#39;absence de compléter entrée visuelle (figure 2B). En tant que tel, les frontières entre visuel avec cortex non visuel (c.. Cortex somatosensoriel à plusieurs sections antérieure et le cortex auditif dans plusieurs sections postérieures) ont été découverts. Résultats de ME souris avec un temps de survie d&#39;une semaine de visualiser les régions d&#39;entrée spécifiques de l&#39;oeil dans le cortex visuel controlatéral. Les deux régions monoculaire entraînés étaient hypoactif et situés medial et latérale de la zone centrale binoculaire (figure 2C). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51936/51936fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: L&#39;évaluation qualitative de l&#39;état de l&#39;orbite de l&#39;œil, l&#39;œil enlevé et le nerf optique post-énucléation. Après l&#39;élimination de l&#39;œil avec une pince courbe (A) pas de saignement ou les dommages sont observés dans l&#39;orbite (B). L&#39;œil est enlevé complètement intacte comme en témoigne une apparence normale de la cornée et de la choroïde (C, D). Le nerf optique est resserré au niveau du disque optique où elle laisse l&#39;oeil (D). L&#39;examen de la partie ventrale du cerveau révèle un nerf coupé propre optique (astérisque) et aucun dommage apparent à d&#39;autres structures (E). Les barres d&#39;échelle en C, D: 1 mm. La barre d&#39;échelle dans E: 5 mm. A: antérieur; L: gauche; P: postérieur; R: droite. Figure 2 fonctionnels des subdivisions spécifiques œil entrée dans le cortex visuel de la souris comme l&#39;a révélé par l&#39;énucléation. Les lignes noires et grises qui relient les yeux et le cortex représentent le croisement des fibres afférentes de la rétine et des régions spécifiques d&#39;entrée de l&#39;oeil. L&#39;activité neuronale est visualisée sur des coupes coronales de contrôle (A), BE (B), et ME (C) chez la souris par radioactive hybridation in situ (ISH) dans des zif268 (échelle de gris) autour du niveau Bregma -3,40 mm. Chez les animaux témoins (A), le cortex visuel dans les deux hémisphères exprime une activité élevée suite à une stimulation visuelle. Quand un ou les deux yeux (s) sont disparues du pays, une nette diminution du signal d&#39;activité est visible dans les régions corticales privées correspondant. Monoculaire énucléé souris (C) montrent une zone de haute activité dans la zone binoculaire du cortex visuel entouré par un signal de diminution dans les zones monoculaires à l&#39;oeil controlatéral enlevé. Barre d&#39;échelle: 2 mm. Reproduit avec la permission de Van Brussel et al 12.

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A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

La suppression des yeux, aussi appelé l&#39;énucléation, fournit une stratégie utile pour étudier les aspects de visuel, multi-modal, et la plasticité du développement le long du système visuel des mammifères, car il induit irréversible partielle (monoculaire) ou complète (binoculaire) la perte de vision. Nous décrivons ici une approche hautement reproductible et simple à effectuer dans l&#39;énucléation in vivo.

Une méthode hautement reproductible et facile à Effectuer<em&gt; In Vivo</em&gt; Oculaire énucléation chez la souris après ouverture des yeux

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

23.2K vues.  KU Leuven - University of Leuven.  La suppression des yeux, aussi appelé l'énucléation, fournit une stratégie utile pour étudier les aspects de visuel, multi-modal, et la plasticité du développement le long du système visuel des mammifères, car il induit irréversible partielle (monoculaire) ou complète (binoculaire) la perte de vision. Nous décrivons ici une approche hautement reproductible et simple à effectuer dans l'énucléation in vivo. 

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

L&#39;énucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Recherche

Médecine

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

Vidéo-oculographie chez la souris

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Neurosciences

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Biologie

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the cortex to the contralateral eye to a stimulus is much stronger than the response of the ipsilateral eye in the binocular segment of the mouse primary visual cortex (V1). During the mammalian critical period, suturing the contralateral eye will result in a rapid loss of responsiveness of V1 cells to contralateral eye stimulation. With the continuing development of transgenic technologies, more and more studies are using transgenic mice as experimental models to examine the effects of specific genes on ocular dominance (OD) plasticity. In this study, we introduce detailed protocols for monocular visual deprivation and calculate the change in OD plasticity in mouse V1. After monocular deprivation (MD) for 4 days during the critical period, the orientation tuning curves of each neuron are measured, and the tuning curves of layer four neurons in V1 are compared between stimulation of the ipsilateral and contralateral eyes. The contralateral bias index (CBI) can be calculated using each cell&#39;s ocular OD score to indicate the degree of OD plasticity. This experimental technique is important for studying the neural mechanisms of OD plasticity during the critical period and for surveying the roles of specific genes in neural development. The major limitation is that the acute study cannot investigate the change in neural plasticity of the same mouse at a different time.

Here, we present detailed protocols for monocular visual deprivation and ocular dominance plasticity analysis, which are important methods for studying the neural mechanisms of visual plasticity during the critical period and the effects of specific genes on visual development.

Mesure de la plasticité de la chirurgie visuelle monoculaire et de la dominance oculaire dans le cortex visuel primaire de la souris

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...

Biologie du développement

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Induite par la ponction de néovascularisation Iris comme un modèle de souris de Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Protocoles d’atteinte des fibres sensorielles cornéennes pour les études de régénération axonale

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche sur l’innervation cornéenne grâce à des modèles novateurs 

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

Microdissection of the Rodent Eye

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, to obtain the anterior and posterior eyecups. With this technique, the sub-parts of the eye, including the corneal tissue, neural tissue, retinal pigment epithelial (RPE) tissue, and lens, can be obtained for wholemounts, cryo-sectioning, and/or single-cell suspensions of a specific ocular tissue. The presence of the third eyelid presents unique and significant advantages, as it benefits the maintenance of the orientation of the eye, which is important for understanding eye physiology following any localized intervention or in studies involving ocular analysis relating to the eye&#39;s spatial topography.
In this method, we enucleated the eyeball at the socket along with the third eyelid by carefully and slowly cutting through the extraocular muscles and severing the optic nerve. The eyeball was pierced through the corneal limbus using a microblade.&#160;The incision was used as the point of entry, allowing for cutting along the corneal-scleral junction by inserting micro-scissors through the incision point. Small and continuous cuts along the circumference were made until the cups separated. These could be further dissected by gently peeling the translucent layer of the neural retina using Colibri suturing forceps to obtain the neural retina and RPE layers. Further, three/four equidistant cuts were made from the periphery perpendicularly to the optic center until the optic nerve was reached. This opened the hemispherical cups into a floret shape so that they fell flat and could be easily mounted. This technique has been used in our lab for corneal wholemounts and retinal sections. The presence of the third eyelid delineates the nasal-temporal orientation, which allows for the study of various cell therapy interventions post-transplantation and, thus, the targeted physiological validation vital for visualization and accurate representation in such studies.

This paper presents a protocol for ocular micro-dissection in rodents. The process involves the enucleation of the eyeball along with the nictitating membrane (i.e., the third eyelid). This is then followed by the separation of the posterior and anterior eye cups.

Microdissection de l’œil de rongeur

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Une méthode hautement reproductible et facile à Effectuer

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Chapitres dans cette vidéo

L'énucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit

Vidéo-oculographie chez la souris

In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes

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Induite par la ponction de néovascularisation Iris comme un modèle de souris de Rubeosis Iridis

Implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

Microdissection de l’œil de rongeur