Les auteurs tiennent à remercier Eleanor Fleming et Jessica Chen pour des discussions utiles. Le financement a été fourni par l&#39;Institut national des maladies allergiques et infectieuses (NIAID-NIH) et un Prix R15AI079685 Research Corporation Cottrell College Science Award. Soutien aux élèves supplémentaires ont été fournis par le Howard Hughes Medical Institute et le fonds de Staley.

1. Préparation des grandes vésicules lipidiques unilamellaires (LUV) <ol><li> Préparer LUV pour servir de membrane de la cellule imite pour le dosage 19. </li><li> Phosphatidylcholine Mix (POPC, 760,10 g / mol), phosphatidylglycérol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyle phosphatidyléthanolamine (DNS-PAPE, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) dissous dans du chloroforme dans un 50 : ratio de 45:5. Comme chaque dosage nécessite la préparation séparée de LUV à la fois expérimentale et de contrôle, deux flacons gâteau lipidique doit être préparé. 0,376 mg de lipides totaux (0,188 mg de POPC, 0,169 POPG mg et 0,019 mg DNS-PAPE) est généralement suffisant pour fabriquer des vésicules assez pour un essai de translocation unique. </li><li> Evaporer le chloroforme en utilisant un flux de gaz N 2. </li><li> Sécher le gâteau lipides 9-14 heures dans un dessiccateur à vide. </li><li> Préparer un stock de 10 mM de solution tampon HEPES (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM de NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampon HEPES est erored à 4 ° C. </li><li> Préparer une solution stock de 0,4 mM trypsine porcine (23,3 kg / mol) dans 10 mM de tampon HEPES préparé ci-dessus. La trypsine est stocké à -20 ° C et, dans notre pratique, n&#39;est généralement pas soumis à plus de 2 cycles gel-dégel avant utilisation. </li><li> Préparer une solution stock de 4,0 mM d&#39;inhibiteur de Bowman-Birk trypsine (8 kg / mol) dans 10 mM de tampon HEPES solution et conserver à -20 ° C. Dans notre usage, ce stock est réapprovisionné tous les mois et n&#39;a généralement pas l&#39;objet de plus de 3 cycles de gel / dégel, avant qu&#39;il ne soit fait à nouveau. </li><li> Reconstituer expérimentale vésicules multilamellaires (MLV) dans une solution 0,2 mM trypsine en ajoutant un volume égal de trypsine 0,4 mM d&#39;actions et 10 mM solution de tampon HEPES au gâteau des lipides séchés. Pour un seul échantillon de 0.376 mg de lipides totaux, d&#39;un mélange de 150 pi de solution de trypsine et 150 uL de tampon HEPES est suffisante. </li><li> MLV contrôle Reconstituer dans une solution avec 0,2 mM trypsine et 2,0 mM de Bowman-Birk inhibiteur de la trypsine en ajoutant un volume égal à 0.4 mM trypsine stock et 4,0 mM d&#39;inhibiteur de trypsine aux gâteaux secs lipides. Pour un seul échantillon de 0.376 mg de lipides totaux, d&#39;un mélange de 150 pi de solution de trypsine et 150 uL d&#39;inhibiteur de trypsine est suffisante. </li><li> Transfert des solutions MLV partir des flacons en verre de 1,7 ml microtube. </li><li> Sujet MLV solutions à 5 cycles gel / dégel dans l&#39;azote liquide. </li><li> Préparer des lipides extrudeuse (Avanti Polar Lipids) en plaçant deux supports de filtre imbibé dans du tampon HEPES sur chaque pièce en téflon extrudeuse. Placez une membrane Nuclepore piste gravé avec 0,1 um pores (Whatman, Royaume-Uni) entre les deux pièces extrudeuse téflon et placer les morceaux à l&#39;intérieur du bidon extrudeuse extrudeuse métal. Placer l&#39;entretoise beigne sur les morceaux extrudeuse deux avant serrage du haut de la cartouche métallique de l&#39;extrudeuse et le placer dans le support. </li><li> Remplissez le volume de vide au sein de l&#39;extrudeuse avec 500 mM HEPES uL tampon de 10 avec une seringue en verre de 250 uL de prévenir la perte de l&#39;échantillon vésicule. &lt;/ Li&gt; <li> Chargez chaque échantillon MLV dans l&#39;extrudeuse et pousser l&#39;échantillon à travers la membrane au moins 21 fois pour assurer l&#39;uniformité de taille des vésicules unilamellaires. LUV sont obtenus à partir de l&#39;extrusion MLV suivantes solution. </li><li> LUV Conserver à 4 ° C et utiliser dans les 48 heures. </li></ol> 2. Quantifier LUV concentration <ol><li> LUV concentration a été quantifiée par la détermination de la teneur en phosphore total dans l&#39;échantillon 20. </li><li> Préparer 8,9 H 2 SO 4 dans l&#39;eau nanopure et stocker à température ambiante. </li><li> Préparer un 2,5% p / v d&#39;ammonium molybdate VI (588,04 g / mol) solution dans l&#39;eau nanopure. Préparer un acide ascorbique à 10% p / v (176,1 g / mol) solution dans l&#39;eau nanopure. Protéger la solution d&#39;acide ascorbique à partir exposition à la lumière en couvrant le tube de papier d&#39;aluminium. Stocker à la fois des solutions à 4 ° C pour un maximum de 2 mois. </li><li> Préparer une solution 0,65 mM de tampon phosphate (phosphate monobasique de sodium anhydre, 120 g / mol). </li><li> Préparez six standards TUbes. Les normes devraient contenir 0,0 ul, 50 ul (0,0325 umol), 100 pl (0,065 umol), 175 uL (0,114 umol), 250 ul (0.163 pmol), ou 350 pi (0,228 umol) de solution de phosphore. </li><li> Préparer LUV tubes d&#39;échantillons en trois exemplaires. Chaque tube échantillon ne devrait contenir environ 0,1 micromoles de LUV. Expérimentaux et de contrôle des concentrations LUV doit être mesuré séparément. </li><li> Afin de corriger tous les sels de phosphore dans la poudre séchée inhibiteur de Bowman-Birk, un contrôle LUV vierge doit être préparé. Le blanc doit contenir le même volume de la solution de 0,2 mM trypsin/2.0 mM inhibiteur de Bowman-Birk comme cela a été placée sous le contrôle LUV tube d&#39;échantillon. </li><li> Placer 450 ul de 8,9 H 2 SO 4 dans chacune des échantillons, standards et tubes vides. </li><li> Échantillons de chaleur, des normes, et des flans pendant 25 minutes à 175-210 ° C dans un four. </li><li> Retirez tous les tubes et les laisser refroidir. Ajouter 150 ul de 30% de H 2 O 2 à chacun des TUbes. </li><li> Échantillons de chaleur, des normes et des flans pour 30 minutes à 175-210 ° C. </li><li> Retirer les échantillons, les normes, et des flans de la chaleur. Si aucune des solutions ne sont pas encore incolore, ajouter 50 ul de H 2 O 2 à l&#39;ensemble des tubes et de chaleur pour un 15 minutes supplémentaires à 175-210 ° C. </li><li> Ajouter 3,9 ml nanopure H 2 O, 0,5 ml de solution de molybdate d&#39;ammonium et 0,5 ml d&#39;acide ascorbique solution à chaque tube. </li><li> Chauffer tous les tubes pendant 5-7 minutes dans un bain d&#39;eau bouillante. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance de chaque standard et échantillon à 820 nm en utilisant un Agilent 8453 spectrophotomètre UV-visible. Le tube contenant 0,0 mmoles de phosphore doit être utilisé comme le blanc pour toutes les normes et expérimentales LUV échantillons. Le tube contenant le 0,2 mM trypsin/2.0 solution MM inhibiteur de Bowman-Birk devrait être utilisé comme le blanc pour le contrôle LUV échantillon. </li><li> Une courbe linéaire absorbance vs le phosphore contenu standard peut être produite et utilisée pour calculer le total des phosphOrus contenu et LUV concentration des échantillons. </li></ol> 3. Préparation des solutions Peptide <ol><li> Dissoudre peptide dans nanopure H 2 O. Les peptides utilisés dans ce dosage comme décrit doit contenir un résidu tryptophane. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance de la solution de peptide à 282 nm en trois exemplaires. Calculer la concentration de peptide en utilisant le coefficient d&#39;extinction molaire pour le tryptophane de 5700 M -1 cm -1. </li><li> Diluer peptide dans l&#39;eau nanopure à une concentration finale de 30 uM. Conserver à -20 ° C </li></ol> 4. Quantification de translocation <ol><li> Préparer les échantillons expérimentaux et de contrôle dans 1,7 ml microtubes. Ajouter LUV suffisant pour chaque solution pour une concentration finale de 250 uM. Ajouter suffisamment de solution d&#39;inhibiteur de Bowman-Birk sorte que l&#39;inhibiteur est une concentration finale 10X supérieure à la concentration de trypsine. Ajouter suffisamment de tampon HEPES 10 mM pour porter le volume solution définitive à 450 pi. </li> &lt;li&gt; Place 50 uL solution de peptide dans une cellule Starna micro fluorimètre quartz. Le rapport entre LUV et le peptide est suffisamment élevée pour assurer que pratiquement tous les peptides intacts sont suffisamment près d&#39;un groupe dansyle de donner un signal de FRET, même si aucun n&#39;a transloqué dans la vésicule. Ceci est cohérent avec le FRET similaires observés dans des conditions de contrôle pour des peptides qui font et ne translocation dans les vésicules. </li><li> Ajouter l&#39;échantillon expérimental ou de contrôle pour la solution de peptide dans la cuvette. Cela devrait amener la concentration finale de peptide à 3 uM. </li><li> Commencer un 25 minutes expérimentation fluorescents cinétiques immédiatement après ajout d&#39;expérimentation ou de contrôle LUV solution, prendre une lecture de fluorescence au moins une fois par seconde. Régler la longueur d&#39;onde d&#39;excitation à 280 nm, la longueur d&#39;onde d&#39;émission à 525 nm, et la température à 25 ° C. L&#39;utilisation d&#39;un spectrophotomètre Cary Eclipse de fluorescence, nous avons mis la sensibilité PMT à élevé. </li></ol><html> 5. Génération d&#39;un ratio de translocation quantitatives <ol><li> Définir fluorescence initiale (F o) que la lecture de fluorescence après quinze secondes de la collecte de données. Dans notre configuration de l&#39;appareil, nous avons constaté que les quinze premières secondes de données de fluorescence recueillie ne sont pas fiables en raison de mixage, la fermeture de la chambre d&#39;échantillonnage, et d&#39;autres perturbations dans le système lors de l&#39;addition de l&#39;échantillon. Divisez chaque lecture ultérieure par F o pour obtenir fluorescence relative (F / F 0) à chaque point de temps. </li><li> Moyenne de tous les relevés relatifs de fluorescence de la dernière minute de l&#39;expérience pour obtenir une finale de fluorescence relative moyenne <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> Divisez la <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> pour les échantillons de contrôle par le <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> pour les échantillons expérimentaux pour obtenir une valeur corrigée finale de fluorescence. </li></ol>Le &quot;&gt; 6. résultats représentatifs La figure 2 montre les résultats de ce dosage pour un peptide représentant qui a montré une translocation robuste. Le signal dans cette expérience (noir trace) montre une baisse marquée de signal de FRET au fil du temps. Cependant, il est important de contrôler la perte potentielle de signal de FRET due à l&#39;inhibition de trypsine incomplète ou d&#39;autres facteurs non liés à la capacité de translocation. À cette fin, nous avons toujours aussi mesurer le signal de FRET entre le peptide et LUV contenant à la fois de la trypsine et de Bowman-Birk inhibiteur de la trypsine (gris trace, figure 2). Dans nos mains, il a été important d&#39;effectuer ce contrôle pour chaque peptide à chaque fois une expérience est exécuté. Cela nous permet de bien correct pour tout changement de signal due à des différences entre les préparations de vésicules lipidiques ou le bruit instrument, qui peut être important pour les signaux relativement faibles fluorescents généralement observée à ces concentrations. L&#39;importance de l&#39;expérience de contrôleriment avec LUV contenant l&#39;inhibiteur de trypsine est mis en évidence par les données de la figure 3. Dans ce cas, le peptide signal diminué d&#39;un montant similaire à celui de la figure 2 dans l&#39;échantillon expérimental (trace noire). Toutefois, l&#39;échantillon de contrôle montre une diminution plus rapide pour ce peptide, donc sa translocation nette est inférieure. L&#39;article 5 de notre protocole décrit une méthode simple pour quantifier la translocation de cette expérience. Ratios de translocation supérieur sont révélateurs de peptides qui translocation efficace; le ratio de translocation pour le peptide pénétrant la cellule de la figure 2 est de 1,16, tandis que faiblement peptides ont des ratios de translocation translocation proche de 1. Dans notre expérience, l&#39;erreur standard pour trois expériences indépendantes réalisées avec des préparations de vésicules différents dans la gamme de 0,01 à 0,06. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma du translocattest d&#39;ions. expérimentale LUV échantillons (A) sont dopés par fluorescence PAPE dansyle (barres noires) et contiennent encapsulés trypsine (ciseaux). Inhibiteur de la trypsine (cercle rouge) est utilisée pour inhiber la trypsine en dehors de la LUV. Les LUV sont exposées au peptide (violet). Peptide association avec les membranes des rendements LUV un signal de FRET (verte) qui diminue à mesure que les peptides translocting rencontre désinhibée trypsine interne. Tant la trypsine et l&#39;inhibiteur de trypsine sont encapsulées dans le contrôle LUV échantillons (B) pour mesurer la diminution du signal de FRET rien à voir avec la translocation. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> Figure 2. Des données représentatives pour un peptide de pénétration cellulaire. Un représentant translocation pepide antimicrobiens montre une baisse significative de signal de FRET par rapport à son contrôle. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> Figure3. Des données représentatives soulignant l&#39;importance de la commande. Inhibition incomplète de la digestion tryptique d&#39;un peptide non-translocation entraîne une baisse de signal de FRET au fil du temps dans les deux expérimentaux et de contrôle LUV solutions. Parce que la différence entre le contrôle et la trace expérimentale est relativement faible, ce mutant est caractérisé comme un peptide faiblement translocation.

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	<li>Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides+and+antimicrobial+peptides:+how+different+are+they?.">Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?.</a> Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).</li><li>Trehin, R., Merkle, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chances+and+pitfalls+of+cell+penetrating+peptides+for+cellular+drug+delivery.">Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery.</a> Eur. J. Pharm. 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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le protocole présenté ici peut être utilisé pour évaluer la variation relative de la concentration des peptides à l&#39;intérieur et en dehors des vésicules lipidiques. Ces changements sont liés à la capacité de translocation. Ce protocole peut être utilisé pour identifier des peptides de pénétration cellulaire avec un potentiel en tant que vecteurs de délivrance de médicaments. Comme l&#39;intérêt pour les peptides de pénétration cellulaire se développe, il sera intéressant de voir comment les m?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 Dansyl PE </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Trypsine porcine </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk trypsine / chymotrypsine inhibiteur de </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-extrudeuse </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Molybdate d&#39;ammonium (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> Acide L-ascorbique </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène, solution à 30% </td><td> Produits chimiques Mallinckrodt </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

Il ya un intérêt actif dans les peptides qui traversent facilement les membranes cellulaires sans l&#39;aide de récepteurs membranaires des cellules 1. Beaucoup d&#39;entre eux sont appelés peptides de pénétration cellulaire, qui sont souvent connus pour leur potentiel en tant que vecteurs de délivrance de médicaments 1-3. Par ailleurs, il ya un intérêt croissant dans des peptides antimicrobiens qui opèrent à travers la membrane des mécanismes non lytiques 4,5, en particulier ceux qui traversent les membranes bactériennes sans causer la lyse des cellules et tuer les cellules en interférant avec les processus intracellulaires 6,7. En fait, les auteurs ont de plus souligné la relation entre les peptides de pénétration cellulaire et antimicrobiennes 1,8. Une bonne compréhension du processus de translocation membranaire et de la relation entre la structure peptide et sa capacité à déplacer doivent être effectives, des dosages reproductibles pour la translocation. Plusieurs groupes ont proposé des méthodes pour mesurer la translocation dans unilamel grandevésicules lipidiques LAR (LUV) 9-13. LUV servir de modèles utiles pour les membranes cellulaires des bactéries et eucaryotes et sont fréquemment utilisés dans les études peptide fluorescent 14,15. Ici, nous décrivons notre application de la première méthode développée par Matsuzaki et collègues à considérer les peptides antimicrobiens, tels que magainine et buforin II 16,17. En plus d&#39;offrir notre protocole pour cette méthode, nous présentons également une approche simple pour l&#39;analyse de données qui quantifie la capacité de translocation par ce test. Les avantages de ce test de translocation par rapport aux autres est qu&#39;il a le potentiel de fournir des informations sur le taux de translocation membranaire et ne nécessite pas l&#39;ajout d&#39;un marqueur fluorescent, ce qui peut modifier les propriétés de peptides 18, peptides contenant du tryptophane. En bref, la capacité de translocation dans les vésicules lipidiques est mesurée en fonction du transfert Foster Resonance Energy (FRET) entre les résidus tryptophane natif et dansyl phosphatidyléthanolamine lorsque les protéines sont associées à la membrane externe LUV (figure 1). Pénétration cellulaire des peptides sont clivés en tant qu&#39;ils rencontrent trypsine désinhibée encapsulé avec le GVU, conduisant à la dissociation de la membrane LUV et une baisse de signal de FRET. La baisse du signal de FRET observé pour un peptide translocation est significativement supérieure à celle observée pour la même peptide lorsque la LUV contiennent à la fois de la trypsine et l&#39;inhibiteur de trypsine, ou quand un peptide qui n&#39;apparaît pas spontanément de traverser les membranes lipidiques est exposé à la trypsine contenant LUV. Ce changement de fluorescence fournit une quantification directe de la translocation de peptide dans le temps.

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Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Ce protocole décrit une méthode pour la mesure quantitative de la translocation de peptide dans de grandes vésicules lipidiques unilamellaires. Cette méthode fournit également des informations sur le taux de translocation membranaire et peut être utilisé pour identifier des peptides qui servent efficacement et spontanément croisée bicouches lipidiques.

Mesure translocation peptide dans de grandes vésicules unilamellaires

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Biology

13.8K vues.  Wellesley College. Ce protocole décrit une méthode pour la mesure quantitative de la translocation de peptide dans de grandes vésicules lipidiques unilamellaires. Cette méthode fournit également des informations sur le taux de translocation membranaire et peut être utilisé pour identifier des peptides qui servent efficacement et spontanément croisée bicouches lipidiques.

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grands écrans des banques métagénomiques

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Recherche

Biologie

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column. Two 20L samples can be filtered simultaneously using a single pump unit equipped with four rotating heads. Filtration is done in the field on extended trips, or immediately upon return for day trips. It is important to record the amount of water passing through each sterivex filter unit. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use. This procedure will take approximately 5 hours plus an additional hour for clean up.

Large Volume 20L+ Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column.

Grand volume (20L +) filtration d&#39;échantillons d&#39;eau de mer côtière

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Grand Insérer production bibliothèque génomique de l&#39;environnement

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

L&#39;examen BCL-2 Fonction famille avec de grandes vésicules unilamellaires

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay pour Grands génotypage SNP Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstitution d&#39;une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualisation de la surface captif grande molécules d&#39;ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Tirant des Nanotubes de la Membrane des vésicules unilamellaires géant

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Mesure translocation peptide dans de grandes vésicules unilamellaires

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Grand volume (20L +) filtration d'échantillons d'eau de mer côtière

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Reconstitution d'une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

La visualisation de la surface captif grande molécules d'ADN avec un ADN fluorescent protein peptide de liaison

Tirant des Nanotubes de la Membrane des vésicules unilamellaires géant