فإن الكتاب أود أن أشكر اليانور فليمينغ وتشن جيسيكا لإجراء مناقشات مفيدة. تم توفير التمويل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIH - NIAID) جائزة R15AI079685 ومؤسسة البحوث كلية العلوم جائزة كوتريل. وقدمت دعما إضافيا من الطلاب من معهد هوارد هيوز الطبي وصندوق ستالي.

1. اعداد كبيرة الحويصلات الدهن Unilamellar (LUVs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد LUVs لتكون بمثابة غشاء الخلية يحاكي للمقايسة 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فسفاتيديل كولين مزيج (POPC ، 760.10 جم / مول) ، phosphatidylglycerol (POPG. 770.99 جم / مول) ، 5 - 1 - dimethylaminonaphthalene السلفونيل فسفاتيديل إيثانولامين (DNS - البابا 994.350 جم / مول) (الدهون أفانتي القطبية) يذوب في الكلوروفورم في 50 : نسبة 45:5. كما في كل مقايسة يتطلب إعداد منفصلة من كلا LUVs التجريبية والسيطرة ، يجب أعد اثنان قارورة كعكة الدهون. 0،376 ملغ من الدهون الكلية (0.188 ملغ POPC ، 0،169 ملغ POPG و0.019 ملغ DNS - البابا) هو عادة ما تكون كافية لجعل الحويصلات كافية لإجراء محاكمة إزفاء واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر قبالة كلوروفورم باستخدام تيار غاز N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الكعكة الدهون 9-14 ساعات في مجفف فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخزون 10 العازلة HEPES حل ملم (HEPES 10 مم ، 238.3 غرام / مول ، 45 مم كلوريد الصوديوم ، 58.44 جم / مول ، 1 ملم EDTA ، 372.24 جم / مول درجة الحموضة 7.4). هو الحادي HEPES العازلةored في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون بنسبة 0.4 ملي الخنزيري التربسين (23.3 كجم / مول) في 10 ملي العازلة HEPES أعد أعلاه. يتم تخزين التربسين في -20 درجة مئوية ، وممارستنا ، وعادة لا تخضع لأكثر من 2 تجميد أذاب دورات قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون من 4.0 ملي مثبط التربسين - Birk بومان (8 كغ / مول) في 10 ملي حل العازلة HEPES وتخزينها في -20 درجة مئوية. في استخدامنا ، يتم تجديد هذا المخزون الشهري وعادة لا تخضع لتجميد أكثر من 3 / دورات ذوبان الجليد قبل أن يتم ذلك مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة حويصلات الصفاحات التجريبية (MLVs) في محلول 0.2 ملي التربسين بإضافة حجم مساو من 0.4 ملي التربسين الأسهم و 10 ملي العازلة HEPES حل للكعكة الدهون المجففة. لعينة واحدة من الدهن الكلي 0.376 ملغ ، وهي مزيج من 150 ميكروليتر من محلول التربسين و 150 ميكرولتر من العازلة HEPES كافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MLVs إعادة السيطرة في التوصل إلى حل مع التربسين ملي 0.2 و 2.0 مم مثبط التربسين بومان ، Birk بإضافة حجم مساو من 0.4 الأسهم التربسين ملي و 4.0 ملي مثبط التربسين إلى الدهون الكعك المجفف. لعينة واحدة من الدهن الكلي 0.376 ملغ ، وهي مزيج من 150 ميكروليتر من محلول التربسين و 150 ميكرولتر من مثبط التربسين كافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحلول MLV من قوارير الزجاج إلى 1.7 مل أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موضوع MLV حلول لدورات تجميد / الذوبان 5 في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الطارد الدهون (الدهون أفانتي القطبية) التي تؤيد مرشح وضعت اثنين مبلل في HEPES العازلة على كل قطعة تفلون الطارد. مكان غشاء المسار nuclepore محفورا بنسبة 0.1 مسام ميكرون (Whatman ، المملكة المتحدة) في فترة ما بين قطعتين الطارد تفلون ، ووضع قطعة معدنية الطارد داخل علبة الطارد. هل وضع على قطعة دونات الطارد اثنين قبل تشديد أعلى من علبة معدنية الطارد ووضعه في حامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حجم الفراغ داخل الطارد مع 500 ميكرولتر 10 ملي HEPES العازلة باستخدام محقنة 250 ميكرولتر الزجاج لمنع فقدان عينة حويصلة &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل كل عينة MLV في الطارد ، ودفع من خلال عينة من الغشاء لا يقل عن 21 مرات لضمان موحدة حجم الحويصلة unilamellar. ويتم الحصول على LUVs التالية من قذف MLV الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LUVs تخزين عند 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون 48 ساعة. </li></ol> 2. قياس تركيز LUV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكان تركيز LUV كميا عن طريق تحديد محتوى الفوسفور الكلي في العينة 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 8.9 NH 2 SO 4 في المياه وتخزينها nanopure في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد 2.5 ٪ ث / ت موليبدات الأمونيوم السادس (588.04 جم / مول) حل في الماء nanopure. يعد حمض الاسكوربيك 10 ٪ ث / ت (176.1 غرام / مول) حل في الماء nanopure. حماية حل حمض الاسكوربيك من التعرض للضوء من خلال تغطية أنبوب مع احباط. تخزين كل الحلول في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.65 العازلة الفوسفات حل ملم (أحادي القاعدة فوسفات الصوديوم اللامائية ، و 120 غرام / مول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ست القياسية توبيز. وينبغي أن تتضمن معايير 0.0 ميكرولتر ، 50 ميكرولتر (0.0325 μmoles) ، و 100 ميكرولتر (0،065 μmoles) ، و 175 ميكرولتر (0،114 μmoles) ، و 250 ميكرولتر (0،163 μmoles) ، أو 350 ميكروليتر (0،228 μmoles) من حل الفوسفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد LUV أنابيب العينات في ثلاث نسخ. يجب على كل أنبوب عينة تحتوي على ما يقرب من 0.1 μmoles من LUVs. التجريبية والسيطرة LUV يجب أن تقاس تركيزات بشكل منفصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصحيح أي أملاح الفسفور المجففة في مسحوق مثبط - Birk بومان ، وهو السيطرة LUV يجب أن يكون مستعدا فارغة. يجب أن فارغة تحتوي على نفس الحجم من 0.2 ملي ملي حل trypsin/2.0 مثبط بومان ، Birk كما وضعت في السيطرة LUV أنبوب العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 450 ميكرولتر من 8.9 NH 2 SO 4 في كل من العينة ، ومعيار ، وأنابيب فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات من الحرارة ، والمعايير ، والفراغات لمدة 25 دقيقة في 175-210 درجة مئوية في فرن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع الأنابيب والسماح لهم لتبرد. إضافة 150 ميكرولتر من 30 ٪ H 2 O 2 إلى كل من توبيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات من الحرارة ، والمعايير ، والفراغات لمدة 30 دقيقة في 175-210 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينات ، والمعايير ، والفراغات من الحرارة. إذا كان أي من الحلول ليست بعد عديم اللون ، وإضافة 50 ميكرولتر H 2 O 2 إلى أنابيب جميع والحرارة لمدة 15 دقيقة إضافية على 175-210 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3.9 مل nanopure H 2 O ، و 0.5 مل من محلول النشادر موليبدات و 0.5 مل من محلول حامض الاسكوربيك في كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جميع أنابيب الحرارة لمدة 5-7 دقائق في حمام ماء يغلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس امتصاص كل معيار وعينة في 820 نانومتر باستخدام 8453 اجيلنت الكروماتوجراف الأيوني. ينبغي استخدام أنبوب يحتوي على 0.0 mmoles الفسفور كما فارغة لجميع المعايير والتجريبية LUV العينات. وينبغي استخدام الأنبوب الذي يحتوي على 0.2 ملي ملي trypsin/2.0 حل المانع بومان ، كما Birk فارغة لمراقبة LUV العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن تنتج محتوى الفوسفور الامتصاصية مقابل منحنى خطي القياسية والمستخدمة لحساب مجموع phosphorus LUV المحتوى وتركيز العينات. </li></ol> 3. إعداد حلول الببتيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الببتيد في 2 nanopure O. H يجب أن الببتيدات المستخدمة في هذا الاختبار كما هو موضح تحتوي على واحد بقايا التربتوفان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية من الحل الببتيد بمبلغ 282 نانومتر في ثلاث نسخ. حساب تركيز الببتيد باستخدام معامل الانقراض المولي لالتربتوفان من 5700 سم -1 م -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الببتيد في الماء nanopure إلى التركيز النهائي 30 ميكرومتر. المحل في -20 درجة مئوية </li></ol> 4. إزفاء الكمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نماذج تجريبية والتحكم في أنابيب 1.7 مل microcentrifuge. إضافة إلى ما يكفي من LUVs كل حل نهائي للتركيز من 250 ميكرون. إضافة يكفي بومان ، Birk حل المانع المانع بحيث يتم التركيز النهائي 10X أكبر من تركيز التربسين. إضافة يكفي العازلة HEPES 10 ملم إلى تحقيق حجم الحل النهائي إلى 450 ميكروليتر. </li> &lt;لى&gt; حل مكان الببتيد 50 ميكرولتر في خلية صغيرة Starna مقياس التألق الكوارتز. النسبة بين LUVs والببتيد مرتفعة بما يكفي لضمان أن جميع الببتيدات سليمة في القرب قريبة بما فيه الكفاية لمجموعة دانسيل لإعطاء إشارة الحنق حتى لو أن أحدا translocated في الحويصلة. وهذا يتفق مع الحنق لاحظت في ظروف مماثلة لمراقبة الببتيدات التي لا تفعل ذلك نقل من مكان لآخر داخل الحويصلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة العينة التجريبية أو التحكم إلى حل الببتيد في كفيت. هذا يجب اعادة تركيز الببتيد النهائي إلى 3 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تجربة حركية 25 دقيقة الفلورسنت فور إضافة التجريبية أو السيطرة LUV الحل ، مع قراءة مضان على الأقل مرة في الثانية الواحدة. تعيين الطول الموجي الإثارة عند 280 نانومتر ، والطول الموجي 525 نانومتر في الانبعاثات ، ودرجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية. استخدام الطيف كاري الإسفار الكسوف ، وضعنا PMT لحساسية عالية. </li></ol><html> 5. توليد نسبة الكمية إزفاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعريف مضان الأولية (F س) والقراءة مضان بعد خمس عشرة ثانية لجمع البيانات. في الإعداد أداتنا ، وجدنا أن أول خمس عشرة ثانية من البيانات التي تم جمعها مضان لا يعول عليها بسبب الاختلاط ، وإغلاق غرفة العينة ، وغير ذلك من الاضطرابات في النظام بالإضافة إلى عينة. تقسيم كل قراءة لاحقة بواسطة فهرنهايت للحصول على مضان النسبي (F / F 0) في كل نقطة زمنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​جميع القراءات النسبية مضان من الدقيقة الأخيرة من التجربة النهائية للحصول على مضان النسبي المتوسط <img alt="[F / FO] التقييم" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم <img alt="[F / FO] التقييم" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> لعينات سيطرة <img alt="[F / FO] التقييم" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> لنماذج تجريبية للحصول على تصحيح قيمة مضان النهائي. </li></ol>لو &quot;&gt; 6. النتائج الممثل الشكل 2 يبين نتائج هذا الفحص عن ممثل الببتيد التي أظهرت إزفاء قوية. إشارة في هذه التجربة (أسود التتبع) يظهر انخفاضا ملحوظا في إشارة الحنق على مر الزمن. ومع ذلك ، فمن المهم للتحكم عن الخسارة المحتملة للإشارة الحنق بسبب تثبيط التربسين ناقصة أو عوامل أخرى لا علاقة لها القدرة إزفاء. تحقيقا لهذه الغاية ، ونحن دائما أيضا قياس إشارة الحنق بين الببتيد وتحتوي على كل LUVs التربسين وبومان ، Birk التربسين المانع (رمادي التتبع ، الشكل 2). في أيدينا ، فقد كان من المهم أن تؤدي هذه السيطرة على كل الببتيد في كل مرة يتم تشغيل التجربة. وهذا يسمح لنا لتصحيح بوضوح عن أية تغييرات في إشارة إلى أي نتيجة الاختلافات بين الاستعدادات حويصلة الدهون أو ضوضاء الصك ، والتي يمكن أن تكون كبيرة بالنسبة للإشارات ضعيفة نسبيا الفلورسنت احظ عادة في هذه التركيزات. أهمية السيطرة بةومن ابرز riment باستخدام LUVs تحتوي التربسين المانع من البيانات الواردة في الشكل 3. في هذه الحالة ، فقد انخفض إشارة الببتيد كمية مماثلة لتلك التي في الشكل 2 في العينة التجريبية (تتبع السوداء). ومع ذلك ، فإن نموذج التحكم أكثر انخفاضا سريعا لهذا الببتيد ، لذلك إزفاء صافي أقل. المادة 5 من بروتوكول يصف لنا طريقة واضحة لقياس إزفاء من هذه التجربة. نسب أعلى إزفاء تدل على الببتيدات التي نقل من مكان لآخر بكفاءة ، ونسبة إزفاء لالببتيد اختراق الخلية هو مبين في الشكل 2 هو 1.16 ، في حين أن الببتيدات ضعيفة translocating وقد نسب إزفاء أقرب إلى 1. في تجربتنا ، والخطأ المعياري لأداء ثلاث تجارب مستقلة مع الاستعدادات الحويصلة المختلفة في مجموعة من 0،01-0،06. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي لtranslocatايون مقايسة. LUV عينات تجريبية (A) هي مخدر مع البابا دانسيل الفلورسنت (القضبان السوداء) وتحتوي على مغلفة التربسين (المقص). يستخدم مثبط التربسين (دائرة حمراء) لكبح التربسين خارج LUVs. يتعرض لLUVs الببتيد (اللون الأرجواني). الببتيد بالتعاون مع LUV الأغشية تعطي إشارة الحنق (الأخضر) الذي يتناقص مع الببتيدات translocting قاء التربسين الداخلية غير مأهولة. يتم تغليف كل من التربسين ومثبط التربسين في السيطرة LUV عينات (B) لقياس الانخفاضات في إشارة الحنق لا علاقة لها إزفاء. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> الشكل 2. بيانات تمثيلية للالببتيد اختراق الخلية. ممثل translocating pepide مضادات الميكروبات تظهر انخفاضا كبيرا في إشارة الحنق مقارنة سيطرتها. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> شخصية3. بيانات تمثيلية تسليط الضوء على أهمية السيطرة. تثبيط غير كاملة الهضم زيتية من الببتيد غير translocating يؤدي إلى انخفاض في إشارة الحنق على مر الزمن في كل من التجريبية والسيطرة LUV الحلول. لأن الفرق بين المراقبة والتعقب تجريبية صغيرة نسبيا ، ويتميز هذا المسخ والببتيد translocating ضعيفة.

<ol>
	<li>Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides+and+antimicrobial+peptides:+how+different+are+they?.">Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?.</a> Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).</li><li>Trehin, R., Merkle, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chances+and+pitfalls+of+cell+penetrating+peptides+for+cellular+drug+delivery.">Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).</li><li>Temsamani, J., Vidal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-penetrating+peptides+for+drug+delivery.">The use of cell-penetrating peptides for drug delivery.</a> Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).</li><li>Hale, J. D., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+action+of+cationic+antimicrobial+peptides+on+bacteria.">Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria.</a> Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).</li><li>Nicolas, P., Rosenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+host+defense+peptides.">Multifunctional host defense peptides.</a> FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).</li><li>Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Action+on+Escherichia-Coli+of+Cecropin-P1+and+Pr-39,+2+Antibacterial+Peptides+from+Pig+Intestine.">Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine.</a> Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).</li><li>Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+II:+Buforin+II+kills+microorganisms+by+penetrating+the+cell+membrane+and+inhibiting+cellular+functions.">Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).</li><li>Bobone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thin+line+between+cell-penetrating+and+antimicrobial+peptides:+the+case+of+Pep-1+and+Pep-1-K.">The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K.</a> J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).</li><li>Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Membrane-Translocating+Peptides+by+Orthogonal+High-throughput+Screening.">Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening.</a> J. Am. Chem. Soc.. , (2011).</li><li>Rosenbluh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+histone+proteins+across+lipid+bilayers+and+Mycoplasma+membranes.">Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes.</a> J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).</li><li>Bárány-Wallje, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+reassessment+of+penetratin+translocation+across+lipid+membranes.">A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes.</a> Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).</li><li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+beta-galactosidase+mediated+by+the+cell-penetrating+peptide+pep-1+into+lipid+vesicles+and+human+HeLa+cells+is+driven+by+membrane+electrostatic+potential.">Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential.</a> Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).</li><li>Orioni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+perturbation+by+the+antimicrobial+peptide+PMAP-23:+a+fluorescence+and+molecular+dynamics+study.">Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).</li><li>Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+analyze+tryptophan+fluorescence+in+membranes+properly,+and+why+bother?.">How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?.</a> Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).</li><li>Epand, R. M., Epand, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+as+models+for+antimicrobial+peptides.">Liposomes as models for antimicrobial peptides.</a> Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).</li><li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+novel+antimicrobial+peptide+buforin+2+with+lipid+bilayers:+Proline+as+a+translocation+promoting+factor.">Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor.</a> Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).</li><li>Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+channel-forming+antimicrobial+peptide,+magainin+2,+across+lipid+bilayers+by+forming+a+pore.">Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore.</a> Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).</li><li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+role+of+strongly+charged+sequences+in+amphipathic+cell-penetrating+peptides:+a+fluorescence+study+using+Pep-1.">Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1.</a> FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).</li><li>Torchilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes. , (2003).</li><li>Almeida, P. F., Pokorny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avanti+Polar+Lipids,+Determination+of+Total+Phosphorus.">Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus.</a> Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).</li><li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+translocation+mechanism+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+2.">Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن استخدام بروتوكول المعروضة هنا لتقييم التغير النسبي في تركيز الببتيد داخل وخارج حويصلات الدهنية. وترتبط هذه التغييرات القدرة إزفاء. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الخلايا اختراق الببتيدات مع إمكانات وناقلات تسليم المخدرات. كما مصلحة في اختراق الخلية الب...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> 16:00 حتي 18:01 PG </td><td> الدهون أفانتي القطبية </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 دانسيل PE </td><td> الدهون أفانتي القطبية </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00 حتي 18:01 PC </td><td> الدهون أفانتي القطبية </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> الخنزيري التربسين </td><td> سيغما </td><td> T - 0303 </td></tr><tr><td> بومان ، Birk التربسين / المانع كيموتربسين </td><td> سيغما </td><td> T - 9777 </td></tr><tr><td> مصغرة الطارد </td><td> الدهون أفانتي القطبية </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> موليبدات الأمونيوم (الفقرة) </td><td> Aesar ألفا </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L - حمض الاسكوربيك </td><td> سيغما </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> بيروكسيد الهيدروجين ، حل 30 ٪ </td><td> مالينكرودت المواد الكيميائية </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيغما </td><td> H - 3375 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S - 9625 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> سيغما </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> ناه 2 ص 4 </td><td> سيغما </td><td> S - 0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

هناك اهتمام فعلي في الببتيدات التي عبر أغشية الخلايا بسهولة دون مساعدة من مستقبلات غشاء الخلية 1. ويشار إلى أن العديد من هذه الخلايا واختراق الببتيدات ، والتي كثيرا ما لاحظت لإمكاناتهم وناقلات تسليم المخدرات 1-3. وعلاوة على ذلك ، هناك اهتمام متزايد في الببتيدات المضادة للجراثيم التي تعمل عبر آليات غير غشاء lytic 4،5 ، ولا سيما تلك التي تعبر الأغشية الجرثومي دون أن تسبب تحلل الخلايا وتقتل الخلايا عن طريق التدخل في العمليات داخل الخلايا 6،7. في الواقع ، لقد أشار الكتاب على نحو متزايد إلى العلاقة بين الخلية الببتيدات المضادة للميكروبات واختراق 1،8. الفهم الراسخ لعملية إزفاء الغشاء ، والعلاقة بين هيكل الببتيد وقدرتها على نقل من مكان لآخر يتطلب فعالة ، لإزفاء المقايسات استنساخه. وقد اقترحت عدة مجموعات أساليب لقياس إزفاء في unilamel كبيرةحويصلات الدهنية لار (LUVs) 9-13. LUVs بمثابة نماذج مفيدة لأغشية الخلايا البكتيرية وحقيقية النواة ، وكثيرا ما تستخدم في الدراسات الفلورية الببتيد 14،15. هنا ، ونحن طلبنا من وصف الطريقة التي وضعت في بادئ ماتسوزاكي وزملاء العمل للنظر في الببتيدات المضادة للجراثيم ، مثل magainin buforin والثاني 16،17. بالإضافة إلى توفير بروتوكول لدينا لهذا الأسلوب ، فإننا نقدم أيضا مقاربة مباشرة لتحليل البيانات التي الكمي قدرة إزفاء باستخدام هذا الاختبار. مزايا هذا الاختبار إزفاء بالمقارنة مع الآخرين هي أنه لديه القدرة على تقديم معلومات حول معدل إزفاء غشاء ولا تتطلب إضافة تسمية فلوري ، الذي يمكن أن يغير خصائص الببتيد 18 ، لالتربتوفان التي تحتوي على الببتيدات. لفترة وجيزة ، يتم قياس قدرة إزفاء في الحويصلات الدهون بوصفها وظيفة من طاقة نقل الرنين فوستر (الحنق) بين الأم ومخلفات التربتوفان دansyl فسفاتيديل إيثانولامين عندما ترتبط مع بروتينات الغشاء الخارجي LUV (الشكل 1). والمشقوق اختراق الخلية والببتيدات التي يواجهونها التربسين يحتاطون مغلفة مع LUVs ، مما أدى إلى disassociation من غشاء LUV وانخفاضا في إشارة الحنق. انخفاض الحنق لاحظ إشارة الببتيد translocating أكبر بكثير من تلك التي لوحظت في نفس الببتيد عندما LUVs تحتوي على كل ومثبط التربسين التربسين ، أو عندما يتعرض الببتيد الذي لا يعبر بشكل عفوي الأغشية الدهنية المحتوية على التربسين LUVs. هذا التغيير في مضان يوفر الكمي المباشر لإزفاء الببتيد مع مرور الوقت.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

تفاصيل هذا البروتوكول طريقة لقياس كمية كبيرة إزفاء الببتيد في الحويصلات unilamellar الدهون. هذا الأسلوب يوفر أيضا معلومات حول معدل إزفاء الغشاء ، ويمكن استخدامها لتحديد الببتيدات التي بكفاءة وبشكل عفوي عبر طبقات ثنائية الدهون.

قياس إزفاء الببتيد في الحويصلات الكبيرة Unilamellar

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

measuring-peptide-translocation-into-large-unilamellar-vesicles

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Views.  Wellesley College. تفاصيل هذا البروتوكول طريقة لقياس كمية كبيرة إزفاء الببتيد في الحويصلات unilamellar الدهون. هذا الأسلوب يوفر أيضا معلومات حول معدل إزفاء الغشاء ، ويمكن استخدامها لتحديد الببتيدات التي بكفاءة وبشكل عفوي عبر طبقات ثنائية الدهون.

Video: Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column. Two 20L samples can be filtered simultaneously using a single pump unit equipped with four rotating heads. Filtration is done in the field on extended trips, or immediately upon return for day trips. It is important to record the amount of water passing through each sterivex filter unit. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use. This procedure will take approximately 5 hours plus an additional hour for clean up.

Large Volume 20L+ Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column.

كبيرة الحجم (20L +) الترشيح لعينة من ماء البحر الساحلية

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

مكتبة كبيرة إدراج الجينوم البيئية الإنتاج

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

دراسة BCL-2 وظيفة الأسرة مع حويصلات كبيرة Unilamellar

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium الفحص على نطاق واسع لتطبيقات SNP التنميط الجيني

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

التصور-المربوطة السطحية الكبيرة جزيئات الحمض النووي مع الحمض النووي البروتين الفلوري ملزم الببتيد

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

سحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات أونيلاميلار العملاقة

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...