Así que las células progenitoras interactúan con el medio ambiente para mantener la homeostasis de los tejidos. Y usando este protocolo podemos comenzar a entender cómo los fibroblastos afectan el comportamiento de las células progenitoras esofágicas. El sistema de cocultivo utiliza en primer lugar células aisladas que imitan el nicho normal del progenitor esofágico.
La limpieza de los organoides antes de la obtención de imágenes permite el análisis tanto de las interacciones celulares como de la morfología de los organoides. Este método podría aplicarse a organoides esofágicos humanos. Por ejemplo, utilizando materiales de pacientes sanos o con cáncer.
Al hacerlo, podemos obtener información sobre la función específica de los fibroblastos asociados al cáncer. La disociación de las células epiteliales y estromales es crítica para obtener organoides viables. Bajo digestión resultará en un bajo rendimiento celular, donde la sobredigestión reducirá la viabilidad celular y la capacidad de formación de organoides.
Para comenzar, extirpe mecánicamente la musculis externa del esófago con un microscopio de disección y fórceps. Sostenga el extremo distal del esófago disecado con un par de fórceps y use los otros fórceps para agarrar y tirar del músculo desde el extremo distal hasta el extremo proximal del esófago. Retire y deseche la capa muscular.
Para abrir el esófago longitudinalmente, sostenga un extremo del esófago e inserte la bola de las tijeras de resorte de microdisección en el lumen para evitar daños tisulares. Corte el esófago mientras se sostiene en el extremo y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros, o una placa de 24 pocillos. Sumergir el esófago abierto en 0,5 miligramos por mililitro de termolisina en HBSS e incubar a 37 grados centígrados en un agitador balancín durante 15 minutos.
Después de retirar el esófago de la solución de termolisina, separe cuidadosamente el epitelio esofágico del estroma. Transfiera la capa epitelial y estromal a dos tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitros con 200 microlitros de solución de disociación en HBSS y colóquelos en hielo. Picar el epitelio esofágico con un bisturí afilado y recoger el tejido picado de la placa de Petri con 200 microlitros de solución de disociación.
Transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 800 microlitros de solución de disociación fresca y coloque el tubo con la capa epitelial picada en un agitador balancín a 37 grados centígrados durante 60 minutos. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 20 veces con una punta de pipeta de 200 microlitros cada 15 minutos.
Corte la capa estromal en trozos finos en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de solución de disociación con tijeras de disección y agregue 800 microlitros de solución de disociación fresca. Coloque el tubo en una coctelera balancín a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos de incubación para la solución estromal y 60 minutos de incubación para la solución epitelial, pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo durante otras 20 veces.
Pasar la solución estromal a través de un filtro de células de 70 micrómetros, y la solución epitelial a través de un filtro de células de 40 micrómetros en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 milímetros. Centrifugar a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante eliminando el exceso de líquido con una pipeta de un mililitro. Resuspender el pellet en 200 microlitros de mezcla de anticuerpos.
Después de transferir la mezcla a un tubo de citometría de flujo, incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Agregue tres mililitros de 1% FBS y centrifugar nuevamente durante cinco minutos. Luego resuspender las células en un mínimo de 200 microlitros de 1% FBS.
Agregue uno a 10, 000 marcadores de tinción de células muertas diluidas, cinco minutos antes de la clasificación por fax para aislar las células vivas. Mezcle las células epiteliales y fibroblastos ordenados en una proporción de uno a dos en un tubo. Después de centrifugar a 300 G durante cinco minutos, deseche el sobrenadante retirándolo cuidadosamente con una pipeta de 200 microlitros.
Lave las células una vez resuspendiendo el pellet en medio organoide básico frío y centrifugar nuevamente durante cinco minutos. Coloque las células en hielo y deseche el sobrenadante retirándolo cuidadosamente con una pipeta de 200 microlitros. Resuspenda las células en 10 microlitros de mezcla de matriz por domo y vuelva a colocar el tubo en hielo.
Tome la placa de 48 pocillos precalentada de la incubadora de 37 grados centígrados y haga una cúpula de matriz por pozo. Usando una pipeta de 20 microlitros, agregue 200 microlitros de medio bajo ER precalentado a las cúpulas de matriz que contienen cocultivos organoides y medio ENR a las cúpulas de matriz respectivas que contienen solo organoides epiteliales. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Y durante los primeros dos días, complemente el medio con 10 inhibidores de roca micromolar. Retire el medio organoide y agregue 200 microlitros de PBS helado a las cúpulas de la matriz. Después de colocar la placa en hielo durante cinco a 10 minutos, pipetear hacia arriba y hacia abajo y transferir la solución a un tubo no adherente de 0,6 mililitros.
Centrifugar brevemente durante 30 a 60 segundos a 100G para dejar que los organoides se asienten en el fondo. Después de eliminar el exceso de líquido, agregue PBS helado al tubo y centrifugar nuevamente durante 30 a 60 segundos. Retire el exceso de líquido como se mostró anteriormente y fije el organoide con 200 microlitros de formaldehído frío al 4% en solución de PBS durante 30 minutos en hielo.
Coloque el tubo en posición vertical para dejar que el organoide se hunda y retire el formaldehído. Agregue 500 microlitros de PBS frío para lavar el formaldehído restante. Después de eliminar el exceso de PBS, agregue 500 microlitros de tampón de bloqueo.
Coloque el tubo en un agitador balancín durante 60 minutos a temperatura ambiente. Retire el tampón de bloqueo y resuspenda los organoides en 200 microlitros de tampón de bloqueo con anticuerpos primarios. Coloque los organoides nuevamente en una coctelera durante la noche a cuatro grados centígrados.
Retire la mezcla de anticuerpos primarios y lave los organoides con 500 microlitros de 0.02% Triton X 100 en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente. Repita esto tres veces. Del mismo modo, retire el tampón de lavado y agregue 200 microlitros de anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia en el tampón de bloqueo durante la noche a cuatro grados centígrados.
Vuelva a lavar los organoides usando 0.02% Triton X 100 en PBS seguido de 500 microlitros de PBS. Después de eliminar todo el exceso de líquido, agregue 10 microlitros de solución de limpieza a los organoides e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Coloque un espaciador adhesivo de cuatro pocillos de doble cara de 0,05 milímetros en un portaobjetos de microscopio.
Agregue los 10 microlitros de solución de limpieza con los organoides en un pocillo y coloque un cubreobjetos en la parte superior del espaciador. Adquirir imágenes mediante un sistema de microscopía confocal. Las células progenitoras esofágicas se clasifican en función de su alta expresión integrada de beta cuatro y e-cadherina.
La gráfica de citometría de flujo representativa del aislamiento de células epiteliales muestra el porcentaje de células vivas de todas las células individuales. Aquí se muestra el porcentaje de células progenitoras aisladas de integrina beta cuatro y e-cadherina de todas las células vivas. Los gráficos de citometría de flujo que se muestran aquí representan el porcentaje de fibroblastos alfa positivos aislados con receptores DPP4+ y Pdgf.
Las imágenes de campo brillante con los organoides cocultivados con fibroblastos positivos para el receptor Pdgf alfa H2 BEGFP muestran la señal nuclear de EGFP. Las imágenes de campo brillante de toda la cúpula de la matriz en el día seis se muestran aquí. La eficiencia de formación de organoides se presenta en esta imagen gráfica.
Cada punto representa una cúpula matricial, y la barra representa la media de todos los puntos por condición. Aquí se muestran las imágenes fluorescentes y de campo brillante del cocultivo de organoides del día seis con fibroblastos alfa positivos para el receptor Pdgf. Las imágenes completas de montaje de los organoides cocultivados muestran superficies 3D de los organoides con fibroblastos positivos de vimentina envueltos alrededor y en estrecho contacto con el organoide.
Toda la tinción de montaje de organoides mono y cocultivados con fibroblastos alfa positivos para el receptor de Pdgf revela distintas poblaciones de células basales y suprabasales. La eficiencia de formación de organoides, así como el tamaño del organoide están influenciados por el fibroblasto incluido en el cocultivo. Se esperan variaciones y resultados cuando se utilizan diferentes subpoblaciones de fibroblastos.
La misma estrategia se puede emplear para caracterizar los fibroblastos asociados a tumores tanto en ratones como en humanos.
