ومن ثم، تتفاعل الخلايا السلفية مع البيئة للحفاظ على الاتزان الداخلي للأنسجة. وباستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا البدء في فهم كيفية تأثير الخلايا الليفية على سلوك الخلايا السلفية المريئية. يستخدم نظام الاستزراع المشترك الخلايا المعزولة أولا التي تحاكي مكانة السلف المريئي الطبيعية.
يتيح مسح المواد العضوية قبل التصوير تحليل كل من تفاعلات الخلايا والتشكل العضوي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على عضويات المريء البشرية. على سبيل المثال استخدام مواد من المرضى الأصحاء أو مرضى السرطان.
عند القيام بذلك ، يمكننا الحصول على نظرة ثاقبة للوظيفة المحددة للخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. يعد تفكك الخلايا الظهارية واللحمية أمرا بالغ الأهمية للحصول على عضويات قابلة للحياة. سيؤدي الهضم تحت الهضم إلى انخفاض إنتاج الخلايا ، حيث يقلل الهضم الزائد من صلاحية الخلية وقدرة تكوين الأعضاء.
للبدء ، قم بإزالة العضلات الخارجية للمريء ميكانيكيا باستخدام مجهر تشريح وملقط. أمسك الطرف البعيد من المريء الذي تم تشريحه باستخدام زوج واحد من الملقط واستخدم الملقط الآخر للإمساك بالعضلات وسحبها من الطرف البعيد إلى الطرف القريب من المريء. إزالة وتجاهل طبقة العضلات.
لفتح المريء طوليا ، أمسك أحد طرفي المريء وأدخل كرة مقص زنبرك التشريح الدقيق في التجويف لمنع تلف الأنسجة. اقطع المريء مع التمسك بالنهاية وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، أو صفيحة بئر 24. اغمر المريء المفتوح في 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر حراري في HBSS واحتضانه عند 37 درجة مئوية على شاكر هزاز لمدة 15 دقيقة.
بعد إزالة المريء من محلول thermolysin فصل بعناية ظهارة المريء من السدى. انقل الطبقة الظهارية واللحمية إلى أنبوبي طرد مركزي منفصلين سعة 1.5 ملليلتر مع 200 ميكرولتر من محلول التفكك في HBSS ، وضعهما على الجليد. فرم ظهارة المريء باستخدام مشرط حاد وجمع الأنسجة المفرومة من طبق بتري مع 200 ميكرولتر من محلول التفكك.
نقله إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. أضف 800 ميكرولتر من محلول التفكك الطازج وضع الأنبوب مع الطبقة الظهارية المفرومة على شاكر الروك عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ماصة الحل صعودا وهبوطا حوالي 20 مرة باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر كل 15 دقيقة.
قطع الطبقة اللحمية إلى قطع دقيقة في أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على 200 ميكرولتر من محلول التفكك باستخدام مقص التشريح وإضافة 800 ميكرولتر من محلول التفكك الطازج. ضع الأنبوب على شاكر هزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة من الحضانة للمحلول اللحمي و 60 دقيقة من الحضانة للمحلول الظهاري ، ماصة الحل صعودا وهبوطا لمدة 20 مرة أخرى.
مرر المحلول اللحمي من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، والمحلول الظهاري من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة جديدة 1.5 ملم. أجهزة الطرد المركزي عند 300 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية عن طريق إزالة السائل الزائد باستخدام ماصة ملليلتر واحدة. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة.
بعد نقل الخليط إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي ، احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أضف ثلاثة ملليلتر من 1٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليق الخلايا بحد أدنى 200 ميكرولتر من 1٪ FBS.
أضف واحدا إلى 10،000 علامة بقعة خلية ميتة مخففة ، قبل خمس دقائق من فرز الفاكس لعزل الخلايا الحية. امزج الخلايا الظهارية والخلايا الليفية التي تم فرزها بنسبة واحد إلى اثنين في أنبوب. بعد جهاز الطرد المركزي عند 300 جيجا لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية عن طريق إزالتها بعناية باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
اغسل الخلايا مرة واحدة عن طريق تعليق الحبيبات في الوسط العضوي الأساسي البارد وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق. ضع الخلايا على الثلج وتخلص من المادة الطافية عن طريق إزالتها بعناية باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر. أعد تعليق الخلايا في 10 ميكرولتر من مزيج المصفوفة لكل قبة ووضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد.
خذ صفيحة البئر 48 التي تم تسخينها مسبقا من حاضنة 37 درجة مئوية وقم بعمل قبة مصفوفة واحدة لكل بئر. باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر ، أضف 200 ميكرولتر من الوسط المنخفض ER المسخن مسبقا إلى قباب المصفوفة التي تحتوي على ثقافات عضوية مشتركة ووسط ENR إلى قباب المصفوفة المعنية التي تحتوي على عضويات ظهارية فقط. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
وفي اليومين الأولين ، استكمل الوسط بمثبطات صخور 10 ميكرومولار. قم بإزالة الوسط العضوي وأضف 200 ميكرولتر من الثلج البارد PBS إلى قباب المصفوفة. بعد وضع اللوحة على الجليد لمدة خمس إلى 10 دقائق ، ماصة لأعلى ولأسفل ونقل الحل إلى أنبوب 0.6 ملليلتر غير ملتصق.
أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 30 إلى 60 ثانية عند 100G للسماح للعضويات بالاستقرار في القاع. بعد إزالة السائل الزائد ، أضف برنامج تلفزيوني بارد إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 30 إلى 60 ثانية. قم بإزالة السائل الزائد كما هو موضح سابقا وقم بإصلاح العضو العضوي ب 200 ميكرولتر من البرد ، 4٪ فورمالديهايد في محلول PBS لمدة 30 دقيقة على الجليد.
ضع الأنبوب في وضع مستقيم للسماح للعضوي بالغرق وإزالة الفورمالديهايد. أضف 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد لغسل الفورمالديهايد المتبقي. بعد إزالة PBS الزائد ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر.
ضع الأنبوب على شاكر هزاز لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع وأعد تعليق المواد العضوية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر بالأجسام المضادة الأولية. ضع المواد العضوية مرة أخرى على شاكر هزاز طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
قم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الأساسي واغسل المواد العضوية باستخدام 500 ميكرولتر من 0.02٪ Triton X 100 في PBS لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر هذا ثلاث مرات. وبالمثل ، قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل وأضف 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق الفلوري في المخزن المؤقت المانع طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
أعد غسل المواد العضوية باستخدام 0.02٪ Triton X 100 في PBS متبوعا ب 500 ميكرولتر من PBS. بعد إزالة كل السائل الزائد ، أضف 10 ميكرولتر من محلول المقاصة إلى المواد العضوية واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع فاصل بئر لزج على الوجهين 0.05 ملم على شريحة مجهرية.
أضف 10 ميكرولتر من محلول المقاصة مع المواد العضوية في بئر واحدة وضع زلة غطاء أعلى الفاصل. الحصول على الصور باستخدام نظام الفحص المجهري متحد البؤر. يتم فرز الخلايا السلفية المريئية بناء على تعبير بيتا فور و e-cadherin المتكامل العالي.
يوضح مخطط قياس التدفق الخلوي التمثيلي لعزل الخلايا الطلائية النسبة المئوية للخلايا الحية من جميع الخلايا المفردة. النسبة المئوية لخلايا أسلاف الإنتغرين بيتا أربعة وإي-كادهيرين المعزولة موضحة هنا من جميع الخلايا الحية. تمثل مخططات قياس التدفق الخلوي الموضحة هنا النسبة المئوية للخلايا الليفية الإيجابية لمستقبلات ألفا DPP4 + و Pdgf.
تظهر صور المجال الساطع مع الكائنات العضوية المستزرعة بشكل مشترك مع الخلايا الليفية الإيجابية لمستقبلات Pdgf alpha H2 BEGFP إشارة EGFP النووية. تظهر هنا صور الحقل الساطع لقبة المصفوفة بأكملها في اليوم السادس. يتم تقديم كفاءة تشكيل العضوية من خلال هذه الصورة الرسومية.
تمثل كل نقطة قبة مصفوفة ، ويمثل الشريط متوسط جميع النقاط لكل حالة. يتم عرض صور المجال الساطع والفلورسنت للثقافة العضوية في اليوم السادس مع الخلايا الليفية الإيجابية ألفا لمستقبلات Pdgf هنا. تظهر صور التركيب الكاملة للعضويات المستزرعة بشكل مشترك أسطح 3D للعضويات مع الخلايا الليفية الإيجابية vimentin ملفوفة حولها وعلى اتصال وثيق مع العضوي.
يكشف تلطيخ التركيب الكامل للعضويات أحادية والمستزرعة بشكل مشترك مع الخلايا الليفية الإيجابية لمستقبلات ألفا Pdgf عن مجموعات متميزة من الخلايا القاعدية وفوق القاعدية. تتأثر كفاءة تشكيل العضو وكذلك الحجم العضوي بالخلايا الليفية المدرجة في الثقافة المشتركة. من المتوقع حدوث اختلافات ونتائج عند استخدام مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الليفية.
يمكن استخدام نفس الاستراتيجية لتوصيف الخلايا الليفية المرتبطة بالورم في كل من الفئران والبشر.
