Demostramos el uso de una herramienta de aprendizaje automático supervisada por simulación para analizar mitocondrias en imágenes de microscopía fluorescente de células fijas. Los métodos actuales para segmentar las mitocondrias en imágenes de microscopía incluyen métodos basados en umbrales automáticos como Ostu o segmentación manual. Las técnicas basadas en umbrales funcionan mal cuando la relación señal/fondo es baja.
Por lo general, las imágenes para el análisis morfológico presentan un gran número de mitocondrias, lo que hace que la segmentación manual sea tediosa. Los métodos de aprendizaje profundo supervisados realizan la segmentación con alta precisión, pero requieren una gran cantidad de datos de pares de entrada de verdad en el terreno para el entrenamiento. Este enfoque utiliza un simulador basado en la física para generar pares de imágenes de microscopía y su máscara de forma de verdad en el suelo en 2D, eliminando así la necesidad de anotaciones manuales.
El modelo entrenado en imágenes simuladas se utiliza para segmentar las mitocondrias en imágenes de microscopio real. Utilizamos una herramienta de segmentación basada en el aprendizaje profundo que permite la automatización de esta tarea con alta precisión y que no requiere un conjunto de datos de verdad anotada para el entrenamiento. La simulación comienza con la generación de geometría utilizando curvas paramétricas para la generación de formas.
Los emisores se distribuyen uniformemente y se colocan aleatoriamente en la superficie de la forma generada de modo que la densidad coincida con los valores experimentales. Una PSF 3D del microscopio se calcula utilizando el modelo Gibson-Lanni. Para lograr el fotorrealismo entre las imágenes simuladas y las imágenes experimentales, emulamos tanto los ruidos oscuros como los disparados.
La física básica-verdad se genera en forma de un mapa binario. Evaluamos el efecto del tratamiento con PCCC sobre la morfología mitocondrial de los cardiomioblastos fijos obtenidos con un microscopio confocal. Cultivo celular.
Prepárese para sembrar las células, operando en una campana de flujo laminar estéril, colocando un cubreobjetos para cada condición experimental en un pocillo de una placa de 12 pocillos. Asegúrese de que la suspensión de celda diluida se mezcle correctamente pipeteando el contenido del tubo de centrífuga hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de dispensar el volumen apropiado a cada pozo. Procedimiento experimental.
Aspire los medios de cultivo celular de los pocillos de la placa de 12 pocillos y luego aplique rápidamente medios precalentados frescos a los pocillos de control y los medios precalentados con 10 soluciones CCCP micromolares a los pozos de condición de prueba. Incubar en la incubadora de células 37 grados centígrados durante dos horas. Aspirar los medios de cultivo celular de los pocillos y aplicar la solución de fijación precalentada.
Tinción y montaje de celdas en cubreobjetos. Agregue un medio de montaje de 10 microlitros a un portaobjetos de vidrio preparado para montar un cubreobjetos. Recoja el cubrebocas de la placa de 12 pocillos con pinzas y aplique humedad de los cubreobjetos tocando brevemente el borde y la parte posterior del cubierto con la toalla de papel sin pelusa preparada.
Baje suavemente el deslizamiento de la cubierta hacia abajo en la gota de espera del medio de montaje. Microscopio e imagen. Usando los oculares, ajuste manualmente el nivel Z para tener la muestra enfocada.
Cambie a la pestaña adquirida dentro del software. Utilice la configuración inteligente para seleccionar el canal de fluorescencia que se utilizará para la obtención de imágenes. Centrado en la matriz en el centro de la cubierta con 12 posiciones totales para obtener imágenes.
Coloque la RA centrada en el centro de la cubierta. Es posible crear imágenes de múltiples ubicaciones de forma automatizada. Generación de datos de entrenamiento simulados.
Descarga el código y descomprime el contenido. Siga las instrucciones y el archivo léame para configurar el entorno. Navegue hasta la carpeta llamada src"Haga una copia o use la carpeta 2.
simulación de mitocondrias aireada" y cambiarle el nombre. Esta carpeta contiene todos los archivos relacionados con la simulación de los datos de entrenamiento. Hay tres conjuntos de parámetros que se establecerán para la simulación.
Primero, establezca los parámetros de número de mitocondrias, rango de diámetro, rango de eje Z y densidad de fluoróforos para el simulador en el archivo de configuración por lotes. A continuación, establezca los parámetros ópticos de apertura numérica, ampliación y longitud de onda mínima del conjunto de datos en el microscopio de archivoPSFmode. py"Establezca el valor deseado para el tamaño de píxel y la longitud de onda de emisión en el generate_batch_parallel de fuego.
py"Establezca el tercer conjunto de parámetros con respecto al conjunto de datos de salida, como el tamaño de las imágenes de salida, el número de mosaicos en cada imagen y el número total de imágenes en el archivo generate_batch_parallel. py"Ejecute el archivo generate_batch_parallel. py"para iniciar la simulación.
Para obtener el tamaño final de la imagen, haga una copia de la carpeta denominada 5. Preparación de datos y capacitación / preparación de datos" y navegue hacia él. Establezca los parámetros del número de lote y el número de imágenes por lote, rango de ruido que se agregará en el archivo Data_generator.
py"Ejecute el archivo Data_generator. py"crear las imágenes del montaje. Copie las carpetas denominadas image"y segment" en la carpeta datatrain/train".
Segmentación basada en aprendizaje profundo. Para entrenar el modelo de segmentación para una nueva configuración de imagen de microscopio, navegue hasta la carpeta denominada train"y establezca los parámetros de tamaño de bach, modelo de columna vertebral para la segmentación, el número de épocas y la tasa de aprendizaje para el entrenamiento dentro del archivo denominado train_unet. py"Ejecute el archivo train_unet.
py"para comenzar la capacitación. El proceso de entrenamiento muestra la métrica para evaluar el modelo de segmentación en el conjunto de validación simulado. Una vez completado el entrenamiento, el modelo se guarda como best_model.
h5"en la carpeta denominada tren"Para probar el modelo en las imágenes del microscopio, las imágenes deben dividirse al tamaño deseado por el modelo de tren. Para ello, navegue a la carpeta llamada 6. Prepare los datos de prueba"y copie los archivos de formato PNG de los datos en la carpeta PNG" y ejecute el archivo split_1024_256.
py"Esto creará recortes de tamaño de 256 por 256 de las imágenes en la carpeta de datos. Para segmentar los recortes de imágenes, vaya a la carpeta denominada 7. Probar segmentación" y ejecute el archivo denominado segmento.
py"después de establecer el nombre del modelo guardado que se utilizará. Las imágenes segmentadas se guardan en la carpeta de salida. Análisis morfológico.
Coloque el archivo denominado make_montage. py"en la carpeta llamada 7. Probar segmentación" y ejecute el archivo para unir la salida segmentada al tamaño original de la imagen.
Cree una nueva carpeta denominada 9. Análisis morfológico" en la carpeta de origen y navegue hasta ella. Instale las bibliotecas skan y seaborn usando el comando pip install seaborn skan"Las máscaras de segmentación están esqueletizadas usando la biblioteca llamada skan" para permitir analizar la topología de la mitocondria individual.
Coloque el archivo en la carpeta 9. Análisis morfológico"Organice las imágenes de diferentes grupos del experimento en diferentes carpetas dentro de la carpeta 7. Segmentación de prueba"Ejecute el archivo para crear gráficos para el análisis. Resultados.
El análisis cuantitativo a realizar depende de las preguntas o hipótesis de investigación. En nuestro experimento, estábamos interesados en las tres morfologías diferentes de las mitocondrias, a saber, puntos, "pequeños bits de mitocondrias, bastones" similares a fibras o mitocondrias similares a cuerdas, y redes multiramificadas. Mostramos los resultados del análisis para los dos grupos de células adaptadas a galactosas, el grupo control y el grupo CCCP tratado.
Vemos un aumento significativo en las longitudes medias de las ramas de los puntos, lo cual se espera, dada la hinchazón que sufren las mitocondrias cuando se exponen a CCCP. El porcentaje de mitocondrias en longitudes individuales de bastones y clases de red se reduce significativamente en relación con el control cuando las células han sido tratadas con CCCP, verificando así nuestra hipótesis. Un escenario desafiante para nuestro método es cuando la imagen tiene mitocondrias densamente empaquetadas.
El color rosa indica la mitocondria individual más larga detectada en la imagen, que se debe al mayor error en los resultados de segmentación. Estos casos de fallo pueden detectarse mediante un control de las longitudes de las mitocondrias y mediante el uso de operadores morfológicos. Si bien nuestra aplicación es un ejemplo de cómo realizamos el análisis de la morfología mitocondrial, creemos que dicho análisis y preguntas de investigación a su alrededor pueden formularse para varios aspectos de la mitofagia y experimentos biológicos relacionados.
