Este protocolo permite la caracterización del tráfico intracelular y la secreción de proteínas de la membrana basal utilizando la matriz Drosophila como sistema modelo. La principal ventaja de nuestra técnica es que permite obtener imágenes de alta resolución del tráfico intracelular de proteínas de la membrana basal utilizando proteínas marcadas endógenamente y microscopía de superresolución Airyscan. Aunque este protocolo está desarrollado para obtener imágenes del tráfico intracelular de proteínas de la membrana basal, se puede ampliar para estudiar el tráfico de otras proteínas de interés y otros sistemas biológicos, incluidos el cultivo celular y los organoides.
Para comenzar, después de diseccionar los ovarios de Drosophila en PBS bajo un endoscopio de disección, agregue un mililitro de solución de fijación y fije los ovarios en una plataforma de nutación durante 15 minutos. Retire la solución de fijación y realice dos lavados rápidos, cada uno con un mililitro de PBST. Invirtiendo suavemente los tubos de la microcentrífuga de cinco a seis veces, luego realice cuatro lavados largos de 10 minutos cada uno con un mililitro de PBST en un balancín de plataforma nutating.
Después de realizar la fijación y el lavado, retire el PBST, luego agregue un mililitro de solución de bloqueo y bloquee los ovarios en un balancín de plataforma de nutación durante un mínimo de una hora. A continuación, retire la solución de bloqueo y agregue 300 microlitros de solución de anticuerpos primarios, que contengan anticuerpos primarios diluidos en sus concentraciones apropiadas en la solución de bloqueo. Incubar durante la noche en un balancín de plataforma nutating a 4 grados centígrados.
Después de retirar la solución primaria de anticuerpos, realice dos lavados rápidos y cuatro lavados largos, como se demostró anteriormente, luego retire PBST y agregue 500 microlitros de solución secundaria de anticuerpos que contengan anticuerpos secundarios fluorescentes que detectarán los anticuerpos primarios utilizados. Incubar los ovarios en la solución secundaria de anticuerpos en un balancín de plataforma nutating durante dos horas a temperatura ambiente, luego realizar dos lavados rápidos y cuatro lavados largos en PBST como se demostró anteriormente en un balancín de plataforma nutating. Después del último lavado, use una pipeta P-1000 para pipetear suavemente los ovarios hacia arriba y hacia abajo en el tubo para separar las cámaras de huevos.
Permita que las cámaras de huevos se hundan hasta el fondo manteniendo el tubo en posición vertical durante cinco a 10 minutos. A continuación, retire el PBST con una pipeta Pasteur, dejando aproximadamente 50 microlitros. Después, retire la mayor cantidad posible del PBST restante con una pipeta P-200 y agregue dos gotas de medio de montaje, suficientes para extenderse uniformemente en un deslizamiento de cubierta.
Para permitir una fácil transferencia del medio de montaje viscoso a la corredera desde el tubo de la microcentrífuga, corte el extremo de una punta de pipeta P-200. A continuación, transfiera lentamente todas las cámaras de huevos en el medio de montaje al portaobjetos de vidrio, asegurándose de no crear burbujas. Bajo un microscopio de disección, extienda suavemente los medios de montaje y separe las cámaras de huevos utilizando una nueva punta de pipeta P-200 o pinzas para cubrir un área aproximadamente del tamaño de un deslizamiento de cubierta.
Usando fórceps, coloque cuidadosamente el resbalón de la cubierta en las cámaras de huevos en ángulo para evitar burbujas y guarde el portaobjetos a temperatura ambiente en una superficie plana en la oscuridad durante dos días para polimerizar. Una vez que el medio de montaje se ha curado, la diapositiva se puede almacenar a 4 grados centígrados en la oscuridad durante unas semanas para obtener imágenes. Para visualizar la localización intracelular de las proteínas de la membrana basal, establezca el objetivo en 63x y coloque suavemente una gota de aceite de inmersión en su lente, luego coloque la diapositiva en el objetivo con el deslizamiento de la cubierta frente al objetivo para ubicar la muestra.
Localice la región de interés utilizando el ocular del microscopio epifluorescente, luego seleccione una configuración con los ajustes apropiados para que los fluoróforos tomen imágenes como se describe en el manuscrito. Una vez establecida la configuración, tome una imagen de la muestra seleccionando Live en modo de adquisición y ajuste el zoom entre 2 y 4x para optimizar el área de escaneo de la muestra. Para cada canal individual, seleccione una pista en Canal y haga clic en En vivo.
Ajuste la ganancia maestra y la potencia del láser mientras usa la herramienta indicadora de rango y siga todas las pautas para evitar píxeles saturados como se describe en el manuscrito, mientras repite lo mismo para cada canal. En la ventana de alternancia Modo de adquisición, en Tamaño de imagen, haga clic en SR para maximizar las capacidades del detector y ajustar el tamaño del fotograma automáticamente. Mantenga el promedio a Ninguno en modo Airyscan, ya que generalmente no es necesario y disminuirá el tiempo de escaneo.
Sin embargo, en algunos casos, un promedio de 2x puede mejorar la relación señal-ruido, luego haga clic en Snap para adquirir una imagen. Para adquirir una pila Z, haga clic en la casilla de verificación Pila Z debajo de la pestaña Adquisición. A continuación, seleccione el canal deseado para observar la muestra.
Por ejemplo, el canal DAPI y haga clic en Live para iniciar un escaneo en vivo, luego establezca un rango para la pila Z usando la perilla de ajuste fino en el microscopio. Después, establezca los extremos de la pila Z haciendo clic en Establecer primero y Establecer último. Para una reconstrucción 3D óptima, establezca el intervalo para la pila Z inferior a 0,5 micrómetros para asignar el tamaño del paso y haga clic en Iniciar experimento para comenzar la adquisición de la pila Z.
Una vez obtenidas las imágenes o la pila Z, haga clic en la opción Procesamiento, luego en Método y seleccione Procesamiento Airyscan. Realice el filtro automático para iniciar y, si es necesario, realice un procesamiento manual adicional cambiando el valor de superresolución para obtener los mejores resultados para la muestra. Una vez que se haya determinado el valor SR óptimo, haga clic en Aplicar para generar una imagen procesada.
En el caso de las imágenes Z-stack, procese como un Z-slice o como todo el Z-stack haciendo clic en el cuadro Procesamiento 3D. Para visualizar el tráfico de proteínas en 3D después de la adquisición de una pila Z, genere una imagen 3D haciendo clic en el icono 3D en la ventana de vista previa, que aparecerá en la sección de control de visualización de la imagen procesada de Airyscan. Desde las diferentes opciones de vista 3D, utilice las vistas Superficie o Mixta al ver la estructura de las vesículas.
Para obtener la imagen de la más alta calidad, seleccione la configuración Precisa, ya que la configuración Más rápida será menos precisa y dará lugar a una representación 3D deficiente. Una vez que se haya generado la imagen, manipule la imagen 3D haciendo zoom y girando para enfocar en una ubicación preferida. Una vez obtenida la vista, en la pestaña 3D, seleccione Resolución mostrada y luego haga clic en Crear imagen, que creará una instantánea de la imagen en la misma orientación en la que se vio y se puede guardar y exportar en varios formatos de archivo.
La microscopía confocal se puede utilizar para visualizar la localización intracelular y la deposición de proteínas de la membrana basal como Viking-GFP cuando se optimizan los parámetros de adquisición. Cuando la adquisición y el procesamiento de imágenes se realizan correctamente, la microscopía de superresolución aumenta la resolución de la imagen en comparación con la microscopía confocal. Como lo ilustran las imágenes mejor definidas en el tráfico intracelular de proteínas de membrana basal, como Viking.
La proyección ortogonal permite la visualización de la distribución general de vesículas y compartimentos que contienen proteínas de la membrana basal en una sola imagen utilizando imágenes confocales o de superresolución. Se empleó una reconstrucción 3D mediante el ensamblaje de una pila de secciones Z ópticas tomadas por imágenes confocales o de superresolución para evaluar la localización y distribución de las proteínas de la membrana basal intracelular. Las imágenes de superresolución se pueden utilizar para determinar la localización precisa de las proteínas de la membrana basal en condiciones mutantes.
Por ejemplo, en las células epiteliales de derribo de Crag, las proteínas de la membrana basal se acumulan tanto apical como basalmente, lo que indica que controla la secreción polarizada de las proteínas de la membrana basal. La microscopía confocal y de superresolución también se puede emplear en experimentos de colocalización. Por ejemplo, esta figura muestra la colocalización parcial de Viking-GFP y un marcador de Golgi, GM-130, confirmando que Viking se clasifica en el Golgi antes de la secreción.
Para obtener imágenes eficientes del tráfico de proteínas de la membrana basal utilizando microscopía de superresolución, recomendamos montar cuidadosamente los ovarios y prestar especial atención al establecer los parámetros de adquisición y convolución. Este protocolo está optimizado para visualizar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas de la membrana basal. Sin embargo, se puede modificar fácilmente para obtener imágenes eficientes del tráfico de otras proteínas de interés.
