Nuestro protocolo utiliza sondas de fluoróforo regulares y técnicas simples de preparación de muestras que mantienen la célula fotoda en condiciones fisiológicas para estudiar el proceso celular altamente dinámico y las estructuras subcelulares detalladas. Esta técnica nos permite investigar los procesos celulares a una súper resolución y en condiciones fisiológicas durante un período prolongado sin sacrificar la resolución especial o temporal. Comience cortando una membrana de diálisis de corte de peso molecular de 12 a 14 kilodalton en trozos pequeños y empapando los pedazos con 100 microlitros de medio celular vivo durante aproximadamente cinco minutos.
Mientras las membranas están empapadas, corte el anillo exterior de un tubo de 50 mililitros en trozos pequeños y esterilice los trozos en etanol al 70%. Para la disección y el montaje de los testículos, transfiera diez moscas macho anestesiadas de dos a tres días de edad a un plato de disección bajo un microscopio de disección y use pórceps finos para eliminar los testículos. Cuando se hayan recogido todos los testículos, lave los testículos dos veces en medio de células vivas y use una punta de pipeta para extender de 100 a 150 microlitros de medio de células vivas al plato de fondo de vidrio preparado.
Use pórceps finos para transferir los testículos de mosca al centro del plato y retire todos menos unos 10 microlitros del medio. Rápidamente, coloque la membrana pre-húmeda sobre los testículos y coloque de dos a tres pequeños pesos de plástico en la membrana. Inmediatamente, agregue de 100 a 150 microlitros de medio celular vivo fresco y coloque el anillo de nuevo en el lado elevado del plato.
Coloque el resbalón de la cubierta de nuevo sobre el anillo y gire un pedazo de papel de seda en agua antes de colocar el papel en el resbalón de la cubierta. Luego, cubra el plato con una tapa y asegure el plato en el escenario de un microscopio de súper resolución. Para obtener imágenes de células madre de línea germinal, abra el software de imágenes y encienda la luz transmitida.
Utilice el objetivo 63X para centrarse en el tejido de los testículos y encender los láseres. Haga clic en Vivo"para localizar las células madre germinales. Ajuste el enfoque y haga clic en Tamaño de fotograma"para establecer el tamaño de fotograma entre 512 por 512 y 1024 por 1024 píxeles, y Promediación"para establecer el promedio de fotogramas en uno o dos.
Haga clic en Ganancia maestra"para establecer la ganancia de multiplicación de electrones en menos de 800, y láseres"para establecer la potencia del láser en 1%a 2%Zoom en la región o celda de interés para reducir el tiempo de adquisición de la imagen y para reducir el blanqueo de fotos, y confirme que la imagen se ha configurado de manera óptima antes de hacer clic en Iniciar experimento"para iniciar la captura de imagen de lapso de tiempo. Si Airyscan Acquisition no está configurado de forma óptima, haga clic en "Optimal" en las secciones de tamaño de fotograma, Z-Stack y Scan Area" y optimice el intervalo de tiempo, el número de Z slices y la duración de la proyección de imagen de lapso de tiempo, según el diseño experimental y el tipo de muestra. Después de la creación de imágenes, seleccione Procesamiento, Procesamiento por lotes y Procesamiento de Airyscan, y seleccione las imágenes que se van a procesar.
A continuación, haga clic en Ejecutar proceso"para obtener las imágenes de super resolución. La proyección de imagen viva de la célula de los testículos del drosophila que expresan la tubulina alfa GFP en células de germen del primero tiempo usando un microscopio confocal del disco que gira, permite la visualización de la intensidad asimétrica de las señales de GFP en dos centrosomas, como señal más brillante en el centrosoma de la madre y una señal relativamente más débil en los centrosomas de la hija. La diferencia de brillo es probablemente reflejada por la asimetría temporal de la nucleación de los microtúbulos, pero la morfología detallada y la cantidad de los microtúbulos no se pueden resolver usando microscopía confocal de disco giratorio.
Por el contrario, la proyección de imagen viva de la resolución estupenda de la célula permite la visualización y la cuantificación de la morfología y de los números del microtubule. Esta resolución mejorada también revela patrones de nucleación asimétrica de microtúbulos, elongación y aumento de la interacción con la membrana nuclear. La proyección de imagen viva de la célula también permite la visualización de la invaginación nuclear asimétrica de la membrana, pero no de los microtúbulos individuales que entran directamente en el núcleo.
Por el contrario, esta técnica de súper resolución de células vivas permite la observación directa de estos eventos mediante imágenes simultáneas tanto de microtúbulos como de la lámina nuclear. Durante la metafase, ambos centrómeros hermanos pueden ser detectados como una sola señal usando microscopía de disco giratorio, aunque el accesorio central del microtúbulo no puede ser observado. En cambio, la proyección de imagen viva de la resolución estupenda permite la visualización del accesorio del centrómero del microtúbulo en la profase temprana.
Asegúrese de colocar una membrana sobre los testículos para asegurarse de que no se muevan ni floten durante las imágenes y para optimizar la configuración del microscopio para evitar el fotoblanqueamiento y la toxicidad fotográfica. Hay muchas maneras en que este método se puede aplicar, como para investigar la dinámica de proteínas, el estrés lineal o las defensas y procesos celulares.
