Este protocolo proporciona una técnica de alto rendimiento para estudiar la unión intermolecular entre el ADN y los ligandos. Esta técnica ha demostrado un alto rendimiento en la investigación de un conjunto masivo de estructuras biomoleculares. Lo hace convirtiendo las propiedades químicas mecánicas de moléculas individuales en las de conjuntos moleculares.
Creo que es un experimento muy avanzado, pero hay pocos pasos críticos. Por ejemplo, la alineación del microscopio, el homogeneizador y el tubo de reacción. Estas tres cosas deben estar perfectamente alineadas para rastrear con precisión el cambio en la fluorescencia.
Comience ensamblando el homogeneizador y el microscopio en una mesa de montaje. Después de usar gafas, encienda el microscopio de fluorescencia y luego ajuste el homogeneizador para asegurarse de que el haz de luz de excitación pase a través del centro de la punta dispersa del homogeneizador. Luego prepare una cámara de reacción de fondo plano que tenga cinco centímetros de altura y 1.5 por 1.5 centímetros cuadrados de sección transversal, asegurándose de que el material de la cámara seleccionado no emita fluorescencia para reducir el fondo.
Después, sujete la cámara de reacción en la etapa de muestra del microscopio de fluorescencia y luego ajuste la cámara para sostener la punta dispersante del homogeneizador, asegurándose de que la punta esté ligeramente por encima de la superficie inferior de la cámara de reacción. A continuación, ajuste la posición vertical del homogeneizador y la cámara juntos para asegurarse de que el foco del microscopio esté en la superficie de la punta de dispersión. A continuación, ajuste la posición horizontal de la punta de dispersión para asegurarse de que el área de detección se establece entre el rotor y el estador.
Encienda los canales fluorescentes, de acuerdo con el tinte fluorescente utilizado en el experimento. Antes del experimento de cizallamiento de alta velocidad, se utilizó agua desionizada para probar el cizallamiento con una velocidad de cizallamiento baja. Primero, prepare un ADN telomérico humano con un e-motivo marcado con un tinte y un quencher en sus dos extremos, respectivamente, en agua desionizada como se describe en el manuscrito.
A continuación, diluya el ADN en cinco micromolares en tampón MES de 30 milimolares a pH 5.5 o pH 7.4. A la solución de ADN, agregue el ligando L2H24OTD" en un rango de concentración de cero a 60 micromolares y mezcle la solución suavemente durante 10 minutos para doblar las estructuras del motivo i sin luz. Verifique y minimice la intensidad de fluorescencia de fondo de la cámara de reacción que se llena con agua desionizada utilizando el microscopio fluorescente sin cizallamiento.
Luego configure los parámetros de la cámara CCD utilizando el software con un tiempo de exposición de 0,5 segundos, sensibilidad CCD de 1, 600 y un tiempo de grabación igual a 20 minutos. Con una pipeta larga, agregue la solución de ADN a la cámara de reacción vacía y limpia y cubra la cámara de reacción con una caja negra. Luego inicie el homogeneizador para realizar el cizallamiento a una velocidad de cizallamiento seleccionada que oscila entre 9, 724 por segundo y 97, 245 por segundo durante 20 minutos, con la cámara CCD encendida para grabar los datos.
Después del experimento, retire la cámara y lávela con agua desionizada. Preparar ADN i-motif y agua desionizada. Luego, incubar 10 micromolares de ADN i-motif y 300 microlitros de 30 milimolar tris buffer suplementado con 150 cloruro cúprico micromolar y 300 ácido ascórbico micromolar durante 10 minutos para doblar las estructuras i-motivo.
A continuación, ultra filtre la solución con un dispositivo de ultrafiltración a una fuerza centrífuga de 14, 300 veces G.Reponga la solución a aproximadamente 500 microlitros con 30 tampones tris milimolares suplementados con 300 ácido ascórbico micromolar después de cada filtración. Después de recoger la solución residual, hacer un volumen final de 300 microlitros añadiendo 30 tris milimolares suplementados con 300 micromolares de ácido ascórbico junto con 20 micromolares CalFluor 488 Azide, 20 micromolares HPG y 10 micromolares TBTA. Una vez que se agreguen los reactivos, mueva la solución al cuarto oscuro.
Luego verifique y minimice la intensidad de fluorescencia de fondo de la cámara de reacción llena de agua desionizada usando el microscopio antes de los experimentos de cizallamiento. A continuación, agregue la solución de ADN en la cámara de reacción vacía con una pipeta larga y luego inicie el cizallamiento del homogeneizador a una velocidad de cizallamiento de 63, 209 por segundo durante 20 minutos con la cámara CCD encendida. Después del experimento, retire la cámara y lávela con agua desionizada.
Se observó que la intensidad de fluorescencia del ADN i-motif aumentaba con una velocidad pura que oscilaba entre 9, 724 por segundo y 97, 245 por segundo en un tampón MES de pH 5.5. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia no aumentó cuando el mismo ADN del motivo i se cortó a una velocidad de 63, 209 por segundo, ya que no se pliega a pH 7.4 en el tampón MES. Se evaluó la unión del ligando a las moléculas de ADN i-motivo sometidas al flujo puro, lo que mostró que el incremento de la intensidad de fluorescencia se hizo menos obvio con el aumento de la concentración del ligando.
La constante de disociación se determinó para la interacción entre el ligando y el i-motivo y se encontró que eran 34 micromoles. El motivo i-quelatado de cobre se desplegó a una velocidad de cizallamiento de 63, 209 por segundo, y el de cobre liberado desencadenó la reacción de clic fluorgénico, lo que resultó en una mayor intensidad de fluorescencia con el tiempo. En primer lugar, asegúrese de que el área de detección esté establecida entre el rotor y el estador.
En segundo lugar, verifique y minimice el fondo de fluorescencia. Y, por último, asegúrese de filtrar la reacción antes de realizar la reacción de clic. Este método abre una puerta para explorar la resistencia mecánica, plegando y desplegando todo tipo de polímeros.
Podrían ser otras estructuras de ADN, proteínas u otros polímeros, y su interacción con otros tipos de moléculas. Como se dijo, varias otras macromoléculas podrían estudiarse utilizando este enfoque.
