يوفر هذا البروتوكول تقنية إنتاجية عالية لدراسة الارتباط بين الجزيئات بين الحمض النووي والأربطة. وقد أظهرت هذه التقنية إنتاجية عالية في التحقيق في مجموعة ضخمة من الهياكل الجزيئية الحيوية. وهو يفعل ذلك عن طريق تحويل الخواص الكيميائية الميكانيكية للجزيئات الفردية إلى تلك الخاصة بالمجموعات الجزيئية.
أعتقد أنها تجربة خطوة إلى الأمام ولكن هناك القليل من الخطوات الحاسمة. على سبيل المثال ، محاذاة المجهر ، المجانس ، وأنبوب التفاعل. يجب محاذاة هذه الأشياء الثلاثة تماما من أجل تتبع التغيير في التألق بدقة.
ابدأ بتجميع المجانس والمجهر على طاولة تركيب. بعد ارتداء نظارات واقية ، قم بتشغيل المجهر الفلوري ثم اضبط المجانس للتأكد من أن شعاع ضوء الإثارة يمر عبر مركز الطرف المشتت للمجانس. ثم قم بإعداد غرفة تفاعل مسطحة القاع يبلغ ارتفاعها خمسة سنتيمترات و 1.5 × 1.5 سم مربع في المقطع العرضي ، مما يضمن عدم تألق مادة الغرفة المحددة لتقليل الخلفية.
بعد ذلك ، قم بتثبيت غرفة التفاعل على مرحلة العينة من المجهر الفلوري ثم اضبط الغرفة لعقد طرف التشتت للمجانس ، مما يضمن أن الطرف أعلى قليلا من السطح السفلي لغرفة التفاعل. بعد ذلك ، اضبط الوضع الرأسي للمجانس والغرفة معا لضمان تركيز المجهر على سطح طرف التشتت. ثم اضبط الوضع الأفقي لطرف التشتت للتأكد من ضبط منطقة الكشف بين الدوار والدولتر.
قم بتشغيل قنوات الفلورسنت ، وفقا لصبغة الفلورسنت المستخدمة في التجربة. قبل تجربة القص عالية السرعة ، استخدم الماء منزوع الأيونات لاختبار القص بسرعة قص منخفضة. أولا، قم بإعداد الحمض النووي البشري للتيلوميريك i-motif المسمى بصبغة ومبرد في طرفيه على التوالي في الماء منزوع الأيونات كما هو موضح في المخطوطة.
بعد ذلك ، قم بتخفيف الحمض النووي إلى خمسة ميكرومولير في مخزن MES مؤقت 30 ملليمولار عند درجة الحموضة 5.5 أو درجة الحموضة 7.4. إلى محلول الحمض النووي ، أضف الليجند L2H24OTD"في نطاق تركيز من صفر إلى 60 ميكرومولار واخلط المحلول بلطف لمدة 10 دقائق لطي هياكل i-motif بدون ضوء. تحقق من شدة التألق الخلفية لغرفة التفاعل المملوءة بالماء منزوع الأيونات وقلل منها باستخدام المجهر الفلوري دون قص.
ثم قم بتعيين معلمات كاميرا CCD باستخدام البرنامج مع وقت التعرض على أنه 0.5 ثانية ، وحساسية CCD من 1،600 ، ووقت التسجيل يساوي 20 دقيقة. باستخدام ماصة طويلة ، أضف محلول الحمض النووي إلى غرفة التفاعل الفارغة والنظيفة وقم بتغطية غرفة التفاعل بصندوق أسود. ثم ابدأ تشغيل المجانس لإجراء القص بمعدل قص محدد يتراوح من 9،724 في الثانية إلى 97،245 في الثانية لمدة 20 دقيقة ، مع تشغيل كاميرا CCD لتسجيل البيانات.
بعد التجربة ، قم بإزالة الغرفة واغسلها بالماء منزوع الأيونات. تحضير الحمض النووي i-motif والماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، احتضن 10 ميكرومولار i-motif DNA و 300 ميكرولتر من 30 ملليمولار تريس العازلة مع استكمال 150 كلوريد كوبريك ميكرومولار و 300 حمض الأسكوربيك ميكرومولار لمدة 10 دقائق لطي هياكل i-motif.
بعد ذلك ، قم بترشيح المحلول باستخدام جهاز ترشيح فائق بقوة طرد مركزي تبلغ 14،300 مرة G.قم بتجديد المحلول إلى ما يقرب من 500 ميكرولتر مع مخازن ترايس ثلاثية 30 ملليمولار مكملة ب 300 من حمض الأسكوربيك المولي الدقيق بعد كل ترشيح. بعد جمع المحلول المتبقي ، قم بعمل حجم نهائي قدره 300 ميكرولتر عن طريق إضافة 30 ملليمولار تريس مكمل ب 300 من حمض الأسكوربيك المولي إلى جانب 20 ميكرومولار CalFluor 488 Azide و 20 micromolar HPG و 10 micromolar TBTA. بمجرد إضافة الكواشف ، انقل المحلول إلى الغرفة المظلمة.
ثم تحقق من شدة التألق الخلفية لغرفة التفاعل المملوءة بالماء منزوع الأيونات وقم بتقليلها باستخدام المجهر قبل تجارب القص. بعد ذلك ، أضف محلول الحمض النووي إلى غرفة التفاعل الفارغة باستخدام ماصة طويلة ، ثم ابدأ قص المجانس بمعدل قص 63،209 في الثانية لمدة 20 دقيقة مع تشغيل كاميرا CCD. بعد التجربة ، قم بإزالة الغرفة واغسلها بالماء منزوع الأيونات.
وقد لوحظ أن كثافة التألق في الحمض النووي i-motif تزداد مع المعدل الهائل الذي يتراوح من 9،724 في الثانية إلى 97،245 في الثانية في مخزن مؤقت للأس الهيدروجيني 5.5 MES. ومع ذلك ، لم يتم زيادة شدة التألق عندما تم قص نفس الحمض النووي i-motif بمعدل 63،209 في الثانية ، لأنه لا يطوى عند درجة الحموضة 7.4 في المخزن المؤقت MES. تم تقييم ارتباط الليغاند بجزيئات الحمض النووي i-motif المعرضة للتدفق الهائل الذي أظهر أن زيادة شدة التألق أصبحت أقل وضوحا مع زيادة تركيز الليغاند.
تم تحديد ثابت التفكك للتفاعل بين الليغاند و i-motif ووجد أنه 34 ميكرومول. تم الكشف عن شكل i-motif المخلبي للنحاس بمعدل 63،209 في الثانية ، وأثار النحاس الذي تم إطلاقه تفاعل النقر الفلورجيني ، مما أدى إلى زيادة شدة التألق بمرور الوقت. أولا ، تأكد من تعيين منطقة الكشف بين الدوار و stater.
ثانيا ، تحقق من خلفية التألق وقللها. وأخيرا ، تأكد من تصفية التفاعل قبل إجراء تفاعل النقر. تفتح هذه الطريقة بوابة لاستكشاف القوة الميكانيكية ، قابلة للطي وتتكشف عن جميع أنواع البوليمرات.
يمكن أن يكون هياكل الحمض النووي الأخرى ، والبروتينات ، أو البوليمرات الأخرى ، وتفاعلها مع أنواع أخرى من الجزيئات. كما قيل ، يمكن دراسة العديد من الجزيئات الكبيرة الأخرى باستخدام هذا النهج.
