Hemos desarrollado un método fácil, rápido y rentable de extracción de ADN genómico de C.elegans que funciona muy bien para aplicaciones en el aula y en la investigación. Estos protocolos se pueden utilizar de manera confiable para producir rápidamente plantillas de ADN a partir de una sola o una pequeña muestra de C.elegance para aplicaciones basadas en PCR. Los usuarios que no tienen experiencia en la selección de gusanos o el uso de un micropipetador pueden tener dificultades con los pasos que requieren estas habilidades.
Observar a un practicante experto y practicar puede ayudar. Demostrando el procedimiento estará Farhan Lakdawala, un estudiante graduado de último año de mi laboratorio. Para extraer ADN de un solo gusano Caenorhabditis elegans, primero, establezca el programa de lisis que consiste en un ciclo a 55 grados Celsius durante 10 minutos seguido de 95 grados Celsius durante tres minutos en un termociclador.
Para preparar la solución de lisis, primero, agregue 0.8 microlitros de solución de extracción del kit a la pared interior de un tubo de PCR de 0.2 mililitros sobre hielo. Luego agregue 0.2 microlitros de solución de preparación de tejido del kit a la gota de la solución de extracción y mezcle acariciando. Con la selección de un gusano para la extracción de ADN, primero, identifique un L4 o un animal adulto bajo un microscopio de disección.
Un hermafrodita L4 se puede identificar por una vulva característica que es visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Para identificar un hermafrodita adulto, seleccione uno de los animales más grandes en la placa que pueda tener embriones ovalados visibles en su útero. A continuación, utilizando una selección de alambre de platino, transfiera el animal seleccionado a la solución.
Para recoger el contenido en la parte inferior del tubo, centrífique el tubo durante dos o tres segundos a 2000 x g a temperatura ambiente. Luego coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido anteriormente. Después de que termine este programa de lisis, centrífique brevemente el tubo y póngalo en hielo.
Luego agregue 0.8 microlitros de solución de neutralización del kit y mezcle mediante pipeteo. Una vez más, centrifugue el tubo durante dos o tres segundos a 2000 x g a temperatura ambiente. Si el lisado no se usa inmediatamente, guarde el tubo a cuatro grados Celsius para su uso futuro.
Para extraer ADN de un gusano individual también, primero, establezca el programa de lisis de un ciclo a 55 grados Celsius durante 10 minutos seguido de 95 grados Celsius durante tres minutos en un termociclador. A continuación, prepare la solución de lisis agregando primero dos microlitros de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo de PCR de 0,2 mililitros sobre hielo, seguido de la adición de 0,5 microlitros de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción, luego mezcle el contenido mediante pipeteo. Después de identificar L4 o animales adultos, use una selección de alambre de platino para transferir un número adecuado de animales a la solución.
A continuación, centrifugue el tubo durante dos o tres segundos a 2000 x g a temperatura ambiente, luego coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis previamente establecido. Después de completar el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Luego agregue dos microlitros de la solución de neutralización del kit al tubo y mezcle mediante pipeteo.
Una vez más, centrifugue el tubo durante dos o tres segundos a 2000 x g a temperatura ambiente. Si no se usa inmediatamente, guarde el lisado a cuatro grados Celsius para su uso futuro. El ADN genómico extraído por el protocolo podría usarse con éxito como una plantilla de PCR, tanto el kit comercial como el método tradicional de proteinasa K produjeron ADN con niveles similares de amplificación de PCR de un producto de par de bases 2100 y un producto de par base 500.
El método del kit para la lisis del ADN también proporcionó plantillas de PCR efectivas para una variedad de enzimas adn polimerasas. Incluso en diferentes diluciones, el ADN extraído de un solo animal por el kit comercial apoyó la amplificación por PCR de un fragmento de ADN de 2100 pares de bases con una eficiencia equivalente. Sin embargo, la amplificación de un fragmento de ADN de 500 pares de bases varió con la concentración de la plantilla.
La idoneidad del ADN extraído de un solo animal o de múltiples animales como plantilla de PCR para determinar el genotipo se demostró aún más mediante la amplificación exitosa de un gen y su variante mutada. Como este protocolo implica pipetear un pequeño volumen de reactivos, para garantizar la consistencia, use una mezcla maestra para múltiples reacciones, una buena técnica de tuberías y pipetas bien calibradas. Además, girar hacia abajo el contenido del tubo garantiza una lisis adecuada.
Este método podría ampliarse, adaptarse para extraer ADN genómico de C.elegans para otras aplicaciones posteriores, y podría usarse para extraer ADN de otras especies de nematodos. Dada la simplicidad, velocidad, robustez y bajo costo del protocolo, es muy adecuado tanto para aplicaciones de investigación como de aula donde el tiempo y los recursos son limitados.
