لقد طورنا طريقة سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي الجينومي C.elegans الذي يعمل بشكل رائع لتطبيقات الفصول الدراسية والبحوث. يمكن استخدام هذه البروتوكولات بشكل موثوق لإنتاج قوالب الحمض النووي بسرعة من عينة واحدة أو صغيرة من C.elegance للتطبيقات القائمة على PCR. قد يكافح المستخدمون الذين ليس لديهم خبرة في اختيار الديدان أو استخدام جهاز الماصة الدقيقة مع الخطوات التي تتطلب هذه المهارات.
قد تساعد مشاهدة ممارس ماهر وممارسة. سيوضح الإجراء فرحان لاكداوالا ، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. لاستخراج الحمض النووي من دودة Caenorhabditis elegans واحدة ، أولا ، اضبط برنامج التحلل الذي يتكون من دورة واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق في دورة حرارية.
لإعداد محلول التحلل ، أولا ، أضف 0.8 ميكرولتر من محلول الاستخراج من المجموعة إلى الجدار الداخلي لأنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر على الجليد. ثم أضف 0.2 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج واخلطها عن طريق الملاعبة. مع اختيار دودة لاستخراج الحمض النووي ، أولا ، حدد L4 أو بالغ تحت مجهر تشريح.
يمكن التعرف على خنثى L4 بواسطة فرج مميز مرئي كنصف دائرة شاحبة في منتصف الحيوان. لتحديد خنثى بالغ ، اختر أحد أكبر الحيوانات على اللوحة التي قد تحتوي على أجنة بيضاوية مرئية في رحمها. بعد ذلك ، باستخدام اختيار سلك بلاتيني ، انقل الحيوان المحدد إلى المحلول.
لجمع المحتويات في الجزء السفلي من الأنبوب ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 2000 × g في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري ، وقم بتشغيل برنامج التحلل الذي تم تعيينه مسبقا. بعد انتهاء برنامج التحلل هذا ، قم بطرد مركزي للأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد.
ثم أضف 0.8 ميكرولتر من محلول التحييد من المجموعة واخلطها عن طريق السحب. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 2000 × g في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم استخدام الليزات على الفور ، فقم بتخزين الأنبوب عند أربع درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.
لاستخراج الحمض النووي من الديدان الفردية أيضا ، أولا ، اضبط برنامج التحلل لدورة واحدة على 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق في دورة حرارية. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول التحلل عن طريق إضافة ميكرولترين من محلول الاستخراج من المجموعة أولا إلى الجدار الداخلي لأنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر على الجليد ، يليه إضافة 0.5 ميكرولتر من محلول تحضير الأنسجة من المجموعة إلى قطرة محلول الاستخراج ، ثم خلط المحتويات عن طريق السحب. بعد تحديد L4 أو الحيوانات البالغة ، استخدم سلك بلاتيني لنقل عدد كاف من الحيوانات إلى المحلول.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 2000 × g في درجة حرارة الغرفة ، ثم ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل برنامج التحلل المحدد مسبقا. بعد الانتهاء من البرنامج ، قم بطرد مركزي للأنبوب لفترة وجيزة ووضعه على الجليد. ثم أضف ميكرولترين من محلول التحييد من المجموعة إلى الأنبوب وخلطها عن طريق السحب.
مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان عند 2000 × g في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم استخدامه على الفور ، فقم بتخزين الليزات عند أربع درجات مئوية للاستخدام في المستقبل. يمكن استخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج بواسطة البروتوكول بنجاح كقالب PCR ، حيث أنتجت كل من المجموعة التجارية وطريقة proteinase K التقليدية الحمض النووي بمستويات مماثلة من تضخيم PCR لمنتج زوج أساسي 2100 ومنتج زوج أساسي 500.
كما وفرت طريقة مجموعة تحلل الحمض النووي قوالب PCR فعالة لمجموعة متنوعة من إنزيمات بوليميراز الحمض النووي. حتى في حالات التخفيف المختلفة ، دعم الحمض النووي المستخرج من واحد بواسطة المجموعة التجارية تضخيم PCR لجزء الحمض النووي لزوج 2100 قاعدة بكفاءة مماثلة. ومع ذلك ، فإن تضخيم جزء الحمض النووي لزوج القاعدة 500 يختلف مع تركيز القالب.
وقد تجلت ملاءمة الحمض النووي المستخرج إما من واحد أو من متعددة كقالب PCR لتحديد النمط الوراثي من خلال التضخيم الناجح للجين ومتغيره المتحور. نظرا لأن هذا البروتوكول يتضمن سحب كمية صغيرة من الكواشف ، لضمان الاتساق ، استخدم مزيجا رئيسيا لتفاعلات متعددة ، وتقنية أنابيب جيدة ، وماصات معايرة جيدا. أيضا ، الدوران لأسفل محتويات الأنبوب يضمن التحلل المناسب.
يمكن توسيع نطاق هذه الطريقة ، وتكييفها لاستخراج الحمض النووي الجيني C.elegans للتطبيقات النهائية الأخرى ، ويمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي من أنواع الديدان الخيطية الأخرى. نظرا لبساطة البروتوكول وسرعته ومتانته وتكلفته المنخفضة ، فهو مناسب تماما لكل من تطبيقات البحث والفصول الدراسية حيث يكون الوقت والموارد محدودة.
