Se describieron modelos de trasplante laríngeo en ratones y ratas. El trabajo previo de Senior alter se centró en idear un método más eficiente utilizando las arterias carótidas del donante para la anastomosis, evitando la necesidad de diseccionar las arterias tiroideas superiores. En este video, describimos este procedimiento en ratones.
Este modelo de trasplante laríngeo de ratón permite realizar estudios inmunológicos con facilidad y a bajo costo. Aunque técnicamente es más desafiante debido al tamaño más pequeño de los vasos en comparación con un modelo de rata, este procedimiento se puede realizar en aproximadamente tres horas si se obtiene familiaridad con los pasos quirúrgicos. Después de que el animal esté completamente anestesiado, transfiera el ratón al área de afeitado donde se administrará un 1,5% de isoflurano con un flujo de oxígeno de un litro por minuto a través de una máscara facial para el mantenimiento de la anestesia.
Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie. Afeite el pecho y el cuello del ratón hasta la línea de la mandíbula y aplica crema depilatoria. Y después de 30 segundos, limpie la crema y transfiera el ratón al área quirúrgica.
Inmovilice al ratón y prepare el área quirúrgica tres veces con povidona yodada y alcohol, luego cubra el ratón. Haga una pequeña incisión horizontal justo superior a la muesca supraesternal. Usando tijeras finas, eleve la piel bilateralmente a través de esa incisión hasta la mandíbula y extirpe un segmento de piel en forma trapezoidal.
Extirpe las glándulas salivales bilaterales usando cauterio en la parte superior donde se visualiza una pequeña vena que viaja a través de la glándula. Diseccionar los músculos esternocleidomastoideos bilaterales de los tejidos circundantes y retraerlos lateralmente. Haga una incisión en la línea media en los músculos de la correa y escúbralos bilateralmente teniendo cuidado de no dañar la glándula tiroides subyacente y dejándola en el esófago laringotraqueal o complejo LTE.
Después de este paso, las arterias carótidas bilaterales son visibles. Diseccionar circunferencialmente las arterias carótidas comunes al nivel de la clavícula inferiormente y al nivel de la bifurcación carotídea superiormente. El nervio vago y la vena yugular interna se diseccionan libres de las arterias carótidas y no se incluyen en el injerto adquirido.
Diseccionar las arterias carótidas internas y externas lo suficientemente superior como para poder ligar y dividir. Usando unas suturas de nylon 10-0, liga las arterias carótidas internas de dos a tres milímetros superiores a la bifurcación carotídea. Ligate las arterias carótidas externas al menos tres milímetros superiores al punto de ramificación de la arteria tiroidea superior y ligan las arterias carótidas comunes a nivel del esternón.
Cortar todos los vasos ligados bilateralmente. Mantenga los pedículos vasculares en la parte superior del complejo LTE para evitar daños accidentales durante la disección adicional. Para evitar cualquier fuga de gas o pérdida inadvertida de anestesia, asegúrese de que el animal haya expirado antes de hacer cualquier corte de las vías respiratorias.
Transecto la tráquea por debajo del quinto anillo traqueal y lleve la incisión a través del esófago hasta la fascia prevertebral para liberar el complejo LTE inferiormente. Libere la tráquea y el esófago de la fascia prevertebral subyacente de inferior a superior. Crear una faringectomía anterior justo inferior a la hioides.
Lleve la incisión hasta la fascia prevertebral para liberar el complejo LTE superiormente. Divida cualquier unión de tejido linfoide o conectivo restante entre el complejo LTE y el tejido circundante. Y finalmente, retire el injerto.
Coloque el injerto obtenido en una placa de Petri estéril y lávese con solución salina normal para eliminar cualquier coágulo de sangre. Dilatar las arterias carótidas bilaterales utilizando microdilatadores de un milímetro. Usando una aguja roma de calibre 30, inyecte aproximadamente dos mililitros de solución salina heparinizada en cada arteria carótida para enjuagar el injerto.
Se verá sangre y solución salina saliendo de la arteria carótida contralateral y de los pequeños extremos de los vasos libres, lo que confirma las arterias tiroideas superiores intactas. El injerto se puede dejar en solución salina heparinizada y se puede tomar un breve descanso de hasta tres horas antes de trasplantarlo al receptor. Prepare el ratón receptor exactamente de la misma manera que se describe para el donante después de los pasos de inducción de anestesia, afeitado y preparación quirúrgica.
Inyecte al ratón receptor con analgésico de liberación prolongada por vía subcutánea 30 minutos antes del inicio de la cirugía. Usando un bisturí, haga una incisión en la línea media del cuello que se extienda desde la línea de la mandíbula superiormente hasta el esternón inferiormente. Eleve la piel del lado izquierdo y retírela lateralmente.
Extirpar la glándula salival izquierda cauterizando los vasos superiores como se describió anteriormente. Extirpar el tejido adiposo y linfoide dividiendo cualquier vaso visible con cauterio a baja temperatura. Teniendo cuidado de no dañar la vena yugular externa subyacente.
Diseccionar la vena yugular externa circunferencialmente. Use al menos cinco milímetros de longitud libre del vaso para la anastomosis. Diseccionar el músculo esternomatoideo y retraerlo lateralmente.
Diseccionar circunferencialmente la arteria carótida común desde la clavícula inferiormente hasta la bifurcación carotídea superiormente. Pase el material de fondo debajo de la vena yugular externa y aplique las abrazaderas de vaso B-3 de doble aproximación. Coloque una sutura de nylon 10-0 a través de la pared anterior de la vena yugular externa en la ubicación de la monotomía deseada, y use la sutura para tirar anteriormente del vaso.
Corte profundamente a la sutura con micro tijeras para facilitar la creación de la venotomía de hendidura única del tamaño adecuado, y para garantizar que el corte sea completamente a través de la pared venosa. Con una aguja roma de calibre 30, enjuague el interior de la vena con solución salina heparinizada. Coloque el complejo LTE del donante entre la arteria carótida izquierda del receptor y la vena yugular externa izquierda.
Alinee el extremo libre de la arteria carótida izquierda del donante hacia la vena yugular externa izquierda receptora y bisele el extremo con tijeras afiladas. Usando cuatro suturas interrumpidas de nylon 10-0, anastomosar la arteria carótida izquierda del donante y la vena yugular externa izquierda del receptor de manera integral a lateral. Deslice el material de fondo debajo de la arteria carótida común receptora y aplique las pinzas de vaso A-3 de doble aproximación.
Crear una arteriotomía de la misma manera que la venotomía. Anastomosar la arteria carótida derecha del donante a la arteria carótida izquierda receptora de manera integral a lateral. El uso de seis suturas interrumpidas con nylon 10-0 es ideal para la anastomosis arterial.
Retire las pinzas del lado venoso. Si se encuentra sangrado, aplique una presión suave con puntas de algodón. Retire las pinzas de la arteria e inmediatamente aplique una presión suave con puntas de algodón.
Se espera algo de sangrado en el paso que generalmente se detiene después de un minuto con una presión suave. Verifique la integridad del flujo sanguíneo en la arteria de la vena. Con el flujo arterial intacto, generalmente se observa pulsación de la arteria carótida del donante y la glándula tiroides del donante cambiará de su color transparente enrojecido a su color rojizo original.
También se puede observar la coloración roja de los pequeños recipientes en el complejo LTE. Cierre la incisión de la piel con la sutura de monofilamento 5-0 en forma de correr. Aplique un adhesivo para la piel en la incisión.
Inyecte un mililitro de solución salina tibia por vía subcutánea para tener en cuenta la pérdida de líquido durante la cirugía. Detenga la anestesia y transfiera el ratón a una jaula de recuperación. Observe el ratón en una almohadilla térmica hasta que esté completamente despierto para evitar la hipotermia.
El éxito quirúrgico se puede evaluar inmediatamente después de retirar las pinzas vasculares. La figura A es representativa de una cirugía exitosa porque el flujo sanguíneo se puede visualizar en las arterias carótidas de la laringe del donante y las glándulas tiroides se volvieron rojas. La figura B es representativa de una cirugía fallida porque el flujo sanguíneo no se puede visualizar en las arterias carótidas de la laringe del donante y las glándulas tiroides permanecieron pálidas.
Después de 15 días en ausencia de inmunosupresión, la mayoría de los receptores no tienen flujo sanguíneo al trasplante. La permeabilidad de la arteria se puede evaluar macroscópicamente diseccionando el complejo laringotraqueal libre del tejido receptor circundante y visualizando la anastomosis de extremo a lado. Gracias. Después de ver este video, debe comprender cómo trasplantar heterotópicamente un complejo traqueoesofágico laríngeo de un ratón a otro en aproximadamente tres horas.
Este modelo factible y de costo relativamente bajo ofrece un potencial significativo en el estudio del papel del sistema inmune en el rechazo del complejo laringotraqueal, ofreciendo así el potencial para nuevas terapias en el trasplante de órganos.
