La inmunostaining se utiliza ampliamente en la investigación biomédica para identificar la ubicación de una proteína de interés. La inmunostaining multiplex puede detectar múltiples dianas en la misma muestra utilizando diferentes anticuerpos primarios. El beneficio de este método es el uso de tampones comúnmente disponibles para eliminar la reactividad cruzada de anticuerpos permitiendo la inmunosutención utilizando dos o más anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped.
Demostrando el procedimiento estarán Sophia Zheng, una estudiante de posgrado, y Qiongxia Lyu, una estudiante visitante de mi laboratorio. Antes de la tinción, descerar y rehidratar diapositivas de parafina fijada en formalina con inmersiones de cinco minutos en cada solución como se indica. Después de la segunda inmersión en agua destilada, coloque los portaobjetos en 275 mililitros de solución de citrato sódico hirviendo en la parte inferior de una caja de punta de pipeta con una tapa y coloque la caja en un microondas de 700 vatios a una potencia del 75% durante ocho minutos.
Al final del tratamiento, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de lavar los portaobjetos con tres lavados de cinco minutos de PBST fresco en un frasco de Coplin. Para bloquear cualquier sitio de unión no específico, después del último lavado agitar el exceso de PBST de cada diapositiva y cubrir las diapositivas con un volumen suficiente de una solución de bloqueo adecuada. Después de 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada, agitar el exceso de solución de bloqueo de cada diapositiva y añadir 250 microlitros del primer anticuerpo primario de interés para cada muestra.
Para evitar que las muestras se sequen, las diapositivas pueden estar cubiertas por un trozo de película de parafina. Después de una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara humidificada, lave los portaobjetos tres veces con PBST fresco durante cinco minutos por lavado. Agitar el exceso de PBST y luego cubrir rápidamente cada diapositiva con 250 microlitros de una solución de anticuerpos secundaria apropiada para una incubación de una hora en una cámara humidificada a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco como se ha demostrado y agregue 250 microlitros de estreptavidina recién preparada peroxidasa de rábano picante a cada tobogán. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco. A continuación, sacuda el exceso de PBST y cubra cada diapositiva con 250 microlitros de solución de fluoróforo-tiromida recién preparada.
Un minuto más tarde, sumerja los portaobjetos en PBST fresco seguido de tres lavados de dos minutos en PBST fresco. Después del último lavado, aplique unas gotas de una solución de glicerol a PBS uno a uno en las secciones y compruebe la presencia de una señal de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia. Para eliminar el primer complejo de anticuerpos, coloque los portaobjetos etiquetados con anticuerpos en 275 mililitros de solución de citrato sódico hirviendo durante al menos ocho minutos como se ha demostrado.
Al final del tratamiento, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de lavar los portaobjetos tres veces con PBST durante cinco minutos por lavado. Para manchar para la segunda proteína diana de interés, después del bloqueo para la unión inespecífico como se ha demostrado, etiquete cada muestra con 250 microlitros del segundo anticuerpo primario de interés a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en PBST fresco por lavado antes de cubrir cada diapositiva con 250 microlitros de una solución de anticuerpos secundaria adecuada para una incubación de una hora a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco como se ha demostrado y agregue 250 microlitros de estreptavidina recién preparada peroxidasa de rábano picante a cada tobogán. Para desarrollar la señal para la segunda proteína diana de interés, después de tres lavados PBST, tratar los portaobjetos con la tiramida conjugada de fluoróforo en un espectro de fluorescencia diferente. Para detener el desarrollo de la señal de tiromida, sumerja las diapositivas en PBST.
A continuación, manche las muestras con un tinte nuclear adecuado. Para obtener imágenes por microscopía de fluorescencia, monte cada diapositiva con etiqueta de tinte nuclear con una gota de un medio de montaje adecuado en un cubreobjetos. Utilice el objetivo 4X para localizar el tejido en la diapositiva.
Cambie al objetivo 10X para la toma de imágenes y ajuste el tiempo de exposición a 100 a 400 milisegundos con la fuente de luz entre 40 y 80% de intensidad. A continuación, obtenga imágenes en cada canal sin mover la etapa. Las imágenes de cada canal se pueden combinar para formar una imagen fluorescente multiplex.
Sin desprendimiento entre la primera y la tinción secundaria de anticuerpos, la segunda tinción de tirosina hidroxilasa recogerá señales de la primera proteína diana de interés, lo que resulta en una falsa tinción positiva de tirosina hidroxilasa, por ejemplo en esta muestra dentro de la corteza suprarrenal. Para eliminar la reactividad cruzada de anticuerpos en la peroxidasa de rábano picante de la primera inmunosuchación, se puede realizar un des nudista mediado por microondas de un minuto y ocho minutos, lo que resulta en resultados limpios de doble tinción. No se recoge ninguna señal significativa en las muestras de control negativo.
El despojo de ocho minutos en el tampón de citrato hirviendo también es suficiente para eliminar la reactividad cruzada de anticuerpos para muchos anticuerpos comúnmente utilizados en la glándula suprarrenal. En algunos casos, una señal falsa positiva débil sigue siendo detectable, sin embargo, y un aumento de 20 minutos para el tratamiento de microondas todavía puede no eliminar completamente la reactividad cruzada del anticuerpo. Durante la toma de imágenes por fluorescencia, es importante no mover el escenario al cambiar de canal.
Sin embargo, puede ser necesario reajustar el enfoque para obtener imágenes claras de cada canal. Para cada canal, asegúrese de ajustar el tiempo de exposición para asegurarse de que las señales están expuestas adecuadamente sin píxeles o áreas sobreexpuestas en las imágenes. Durante el procedimiento de tinción, es importante mantener los portaobjetos hidratados de la desceración y Los portaobjetos se pueden despojar utilizando los mismos métodos de desprendimiento varias veces para permitir la tinción multiplex.
