Este es el primer protocolo para purificar y cultivar simultáneamente y eficientemente las neuronas oculares primarias y motoras espinales de ratones embrionarios. Permite el estudio de los mecanismos subyacentes a la enfermedad de las neuronas motoras. Este protocolo añade un nuevo componente de cultivo oculomotor in vitro a los sistemas existentes y proporciona especies puras y cultivos de neuronas motoras espinales coincidentes con la edad para su comparación.
En la esclerosis lateral amiotrófica, las neuronas motoras espinales degeneran mientras que las neuronas oculomotoras se ahorran relativamente. Comparar estos cultivos podría proporcionar información sobre el mecanismo de la enfermedad y la terapia. Este método facilitará los estudios de los mecanismos subyacentes al desarrollo de las neuronas motoras, enfermedad, y la vulnerabilidad selectiva.
Nuestro sistema de cultivo permite la caracterización de la morfología de las neuronas motoras, la biología molecular y la electrofisiología. Para los nuevos en esta técnica, recomendamos mucha práctica. La disección puede ser técnicamente difícil y se pueden requerir múltiples dissectores para obtener suficientes neuronas para el cultivo primario.
Comience por cosechar embriones positivos islet1 EGF de un ratón embarazada aproximadamente 11,5 días después de la fertilización. Rocíe bien el abdomen con etanol y retire el útero con tijeras estériles de microdisección y fórceps para el pulgar. Lave brevemente el útero en PBS estéril.
A continuación, transfiéralo a la placa de disección llena de PBS estéril preenfriado. Bajo la luz brillante del microscopio, retire cuidadosamente los embriones del útero usando tijeras de microdisección, fórceps de apósito para el pulgar y pinzas Dumont 5. A continuación, utilice una mini cuchara perforada Moria estéril para transferir cada embrión a un pozo separado de un plato de 24 pozos lleno de hibernación pre-enfriada E medio de baja fluorescencia complementado con 1X V27.
Mientras mantiene la placa sobre hielo, transfiera un embrión a una placa de disección estéril y cúbrala completamente con la solución de sal equilibrada de Hank estéril helada o HBSS. Use pinzas para extraer la cara del embrión y la cola sin dañar el cerebro medio. A continuación, coloque el embrión propenso con las extremidades entrelazadas y la cola apuntando hacia la parte delantera del microscopio.
Utilice pinzas para abrir el techo del cuarto ventrículo con el fin de generar una pequeña abertura. Utilice esta abertura para enganchar pinzas en el espacio creado entre el cuarto ventrículo y su techo. Diseccionar a lo largo de la superficie dorsal del embrión rostral a la corteza y lateral a la placa del suelo y la columna motora.
A continuación, abra el tejido diseccionado de una manera de libro abierto para revelar los núcleos POSITIVOS de GFP CN3 y CN4. Separe cuidadosamente el cerebro medio ventral del embrión y retire el tejido meningeal con pinzas y un cuchillo de microdisección. Diseccionar los núcleos bilaterales positivos de GFP CN3 y CN4 lejos de la placa del suelo y otros tejidos circundantes positivos de GFP teniendo cuidado de evitar tocar o dañar las neuronas.
Si recoge núcleos CN3 y CN4 separados, corte a lo largo del cerebro medio de estos dos núcleos y utilice una pipeta P1000 para recoger el tejido ventral de cerebro medio diseccionado con un mínimo de HBSS. Colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros con un medio de disección etiquetado y guárdelo sobre hielo hasta su disociación. Continúe tirando de los midbrains ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo hasta que el número total cumpla con los requisitos experimentales.
Para diseccionar la médula espinal ventral, mantenga el embrión propenso con la cabeza mirando hacia la parte frontal del microscopio. Sosténgaselo con un par de pinzas e inserta la punta del otro par en la parte caudal sin abrir del cuarto ventrículo. Abra el resto del cerebro trasero y la médula espinal dorsal sobre toda la extensión rostrocaudal del embrión.
Cortar el tejido dorsal a partir del cuarto ventrículo y trabajar hacia el canal central de la médula espinal caudal usando los fórceps como tijeras. A continuación, sostenga el embrión con un conjunto de pinzas y pellizca el colgajo del tejido dorsal a cada lado con el otro par. Retire la médula espinal ventral utilizando el cuchillo de microdisección para perforar directamente debajo del SMN positivo de la GFP levantando la médula espinal ventral con movimientos similares a sierras en ambos lados.
Corte la médula espinal transversalmente en el límite superior de la extremidad inferior y retire la parte lumbar cervical. Corte transversalmente directamente por encima de C1 donde se proyecta la primera bocina anterior positiva de GFP. Coloque el lado dorsal de la médula espinal ventral hacia arriba y sostén lo sostenga presionando el tejido negativo GFP entre las columnas SMN positivas de GFP con un par de pinzas.
Retire el mesenquimo, los DRG y la médula espinal restante recortando ambos lados de la columna SMN positiva de GFP con el cuchillo de microdisección. Utilice una pipeta P1000 para recoger el tejido de la médula espinal ventral diseccionada con un mínimo de HBSS y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros etiquetado lleno de medio de disección. Guárdelo sobre hielo hasta la disociación y continúe extrayendo las médulas espinales ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo.
Agregue el volumen adecuado de solución de papaína a cada uno de los tubos de microcentrífuga con las muestras de tejido diseccionado. Incubar los tubos a 37 grados centígrados durante 30 minutos agitando los tubos cada 10 minutos moviendo los dedos. Después de la incubación, tritura suavemente cada suspensión ocho veces con una pipeta P200 y centrifugala a 300 veces g durante cinco minutos.
Resuspender los gránulos celulares con el volumen adecuado de solución inhibidora de la albúmina ovomucoide por pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo. Repite la centrifugación. A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta P1000.
Resuspender las células en el volumen apropiado de medio de disección. Filtrar las suspensiones a través de un colador celular de 70 micrómetros. A continuación, utilice la clasificación FACS para aislar las células positivas GFP diseccionadas de CN3/CN4 y SMN.
Diluir las suspensiones celulares aisladas con medio de cultivo de neurona motora precaliente a 37 grados Celsius a las densidades adecuadas y añadir 200 microlitros de la suspensión a un pozo de una placa de 96 pozos recubierta de laminina PDL. Cultivo de las neuronas en un 37 grados Celsius y 5%incubadora de dióxido de carbono asegurándose de actualizar el medio de cultivo de neuronas motoras cada cinco días. Cuando las neuronas aisladas con éxito se cultivaron en cultivo, se obtuvieron y mantuvieron in vitro cultivos primarios casi puros cn3/CN4 y SMN durante 14 días in vitro.
Las purezas de los cultivos a los dos días in vitro fueron del 93,5% para CN3/CN4 y del 86,7% para SMN cuando se evaluaron por inmunocitoquímica con el marcador de neurona motora Islet1 y el marcador neuronal TUJ1. Las purezas dependían en gran medida de la edad de los embriones y en el establecimiento de los umbrales adecuados para las puertas GFP durante el FACS. La pureza de las neuronas aisladas de los embriones E10.5 fue comparable a la de los embriones E11.5.
Sin embargo, la pureza disminuyó significativamente cuando se utilizaron embriones E13.5. Para determinar si los CN3/CN4 primarios y las SN mostraron respuestas diferenciales a los factores estresantes de retículo endoplasmático, las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de ácido ciclopiazázónico o CPA en dos días in vitro y fijadas tres días después para la inmunocitoquímica para evaluar las relaciones de supervivencia. Se contó el número de neuronas viables en cada muestra y se calcularon las relaciones de supervivencia.
Los monocultivos CN3/CN4 eran significativamente más resistentes al tratamiento con CPA en comparación con los monocultivos SMN. Después de este procedimiento, se pueden realizar muchos métodos adicionales para examinar las neuronas motoras. Algunos ejemplos incluyen estudios de electrofisiología, biología celular, transcripción o accesibilidad a la cromatina.
