La coenzima A, llamada CoA para abreviar, es un cofactor importante en el metabolismo celular. Las mediciones cuantitativas revelan cambios que ocurren con estados nutricionales y hormonales en modelos animales. Este método cuantifica la cantidad total de CoA celular, incluyendo derivados de CoA y CoA libre, en un método simple y confiable.
Varios tipos de neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral se asocian con mutaciones en los genes de la vía biosintética de CoA. Este método se puede aplicar a cualquier sistema biológico ya que todos los organismos requieren CoA para la supervivencia, el crecimiento y la función. Un investigador por primera vez puede tener problemas con los primeros pasos en la preparación de la muestra, donde es importante mantener las muestras absolutamente frías y luego transferirlas rápidamente al hidróxido de potasio.
Limite el número de muestras en un lote antes de la transferencia al hidróxido de potasio, y practique con la transferencia antes de trabajar con las muestras experimentales. Muchos investigadores no están familiarizados con la extracción en fase sólida en la preparación de muestras biológicas para análisis bioquímicos posteriores. Para empezar, incubar platos de cultivo triplicado en paralelo, dos para análisis bioquímicos y uno para la determinación del número celular viable.
Cuando el cultivo se acerca a las densidades subconfluentes tardías, por ejemplo, las células humanas HepG2/C3A cultivadas a una densidad de seis a ocho veces 10 a las seis o hek 293T células cultivadas a una densidad de aproximadamente 1,3 veces 10 a las siete por plato de 100 milímetros, cosechar las células adherentes en el cultivo. Luego, agregue un mililitro de agua helada al mismo plato de cultivo. Raspa las células en el agua fría del plato y transfiere la suspensión celular a un tubo de ensayo de vidrio que contiene 400 microlitros de hidróxido de potasio 0,25 molares y 1,5 mililitros de agua para llevar el pH por encima de 12.
Mezclar la suspensión vigorosamente por vórtices en alto durante 10 segundos. A continuación, cubra firmemente con película de parafina, e incubar a 55 grados centígrados durante una hora sin agitar en un baño de agua. A continuación, añada 160 microlitros de solución de clorhidrato de Trizma de un molar y 10 microlitros de 100 mililitrolares mBBr.
Mezclar por vórtices en alto durante 10 segundos. Esto lleva el pH a aproximadamente ocho para apoyar la reacción mBBr con CoA libre. Cubra el tubo con película de parafina e incubar las muestras a temperatura ambiente durante dos horas en la oscuridad para que el mBBr reaccione con el thiol de CoA.
Después de dos horas, añadir 100 microlitros de ácido acético, y mezclar por vórtices durante 10 segundos para detener la reacción. Se forma una precipitación en el tubo. A continuación, centrifugar a 2.000 g durante 15 minutos.
Para eliminar los residuos celulares precipitados, transfiera y guarde el sobrenadante en un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna de extracción de fase sólida. Antes de comenzar el análisis, agregue dos mililitros de hidróxido de potasio de un mililitrolar a un tubo de ensayo de vidrio diseñado para la inserción de una sonda y la interrupción del tejido con un homogeneizador de rotor-estator. Mantenga el tubo sobre hielo hasta su uso.
Pesar las piezas de tejido congelado rápidamente, y registrar el peso húmedo para cada muestra. Transfiera el tejido al tubo de vidrio y homogeneice el tejido durante 30 segundos. Evite el descongelación completa del tejido.
Añadir 500 microlitros de hidróxido de potasio 0,25 molares. Vórtice en alto durante 10 segundos, y manténgase en hielo. Esto lleva el pH de la muestra por encima de 12 para hidrolizar los tioesters de CoA para producir CoA total.
Cubra el tubo con película de parafina. La preparación de células cultivadas y la preparación de tejidos son los pasos más críticos en este procedimiento. Es importante añadir un alto hidróxido de potasio rápidamente para evitar la degradación de CoA.
Incubar las muestras a 55 grados centígrados durante dos horas en un baño de agua sin agitar para apoyar la hidrólisis. A continuación, agregue 150 microlitros de un molar Trizma-hidrocloruro y 10 microlitros de 100 mililitros de mBBr para llevar el pH a unos ocho para apoyar la reacción mBBr con CoA libre. Vórtice a fuego alto durante 10 segundos.
Cubra el tubo con película de parafina e incubar las muestras a temperatura ambiente durante dos horas en la oscuridad para asegurarse de que todo el CoA se deriva con mBBr. Después de eso, añadir 100 microlitros de ácido acético, y vórtice en alto durante 10 segundos para detener la reacción. Centrifugar a 2.000 veces g durante 15 minutos para peletizar los desechos celulares precipitados, y transferir el sobrenadante a un tubo de ensayo de vidrio para la limpieza de la columna de extracción de fase sólida.
A temperatura ambiente, equilibre cada columna de gel de sílice 2-2-pyridyl-ethyl desechable de un mililitro con un mililitro de tampón de lavado para asegurar que el grupo funcional piríi esté protonado y funcione como un intercambiador de aniones. A continuación, pipetee el sobrenadante de la muestra en la columna y recoja el eluido. Lave la columna dos veces con un mililitro de tampón de lavado y una vez con un mililitro de agua para eliminar cualquier especie no contenida.
A continuación, en un tubo de ensayo de vidrio separado, lave la columna dos veces con un mililitro de tampón de elución para recoger el CoA-bimane. Seque la muestra de CoA-bimane en el tubo bajo gas nitrógeno. Selle, cubra completamente el tubo y guárdelo a menos 20 grados centígrados.
Cuando esté listo para el análisis de HPLC, resuspender la muestra en 300 microlitros de agua, y mezclar vigorosamente por vórtices en alto durante 10 segundos. Transfiera la muestra resuspendida a un filtro de tubo centrífuga y centrifugar a 5.000 veces g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitante. A continuación, transfiera la muestra filtrada a un vial de vidrio adecuado para la inyección de HPLC.
En este estudio, un perfil HPLC representativo muestra el tiempo de retención del estándar CoA-bimane en la columna HPLC C18. Las cantidades crecientes del estándar CoA-bimane se inyectaron individualmente, y las áreas bajo los picos en los cromatogramas de CoA-bimane se trazaron en función del CoA-bimane de entrada. La curva estándar reflejaba la magnitud de la absorbancia de CoA-bimane a una longitud de onda de 393 nanómetros.
La fluorescencia de CoA-bimane también se refletió en la longitud de onda de excitación de 393 nanómetros y la longitud de onda de emisión de 470 nanómetros. La separación posterior de HPLC y los perfiles de detección típicos para el hígado de ratón o las células C3A cultivadas en humanos se indican aquí por picos rojos, con un tiempo de retención entre 11 y 12 minutos utilizando el programa de elución. Si la reacción con mBBr no produce resultados detectables, es posible que sea necesario ajustar la cantidad de Trizma-HCl para reducir el pH a aproximadamente ocho.
Es posible detectar moléculas celulares adicionales que contienen mitades de sulfhidril o tioestes como derivados del bimano. Por ejemplo, el glutatión-bimano se puede detectar con el método HPLC. Esta técnica permitirá a otros investigadores investigar el papel potencial de la disfunción del CoA asociada con el desequilibrio metabólico, como los modelos animales de diabetes tipo 2.
Los investigadores deben utilizar equipos de protección personal cuando se trabaja con disolventes orgánicos utilizados para la extracción en fase sólida.
