Las líneas de células HCC4017 y HBEC30KT fueron amablemente proporcionados por el laboratorio del Dr. John Minna. Este trabajo fue apoyado por los fondos de Cecil H. e Ida verdes al Dr. Li Zhang.

PRECAUCIÓN: Mientras trabajaba con radiactividad, tomar las precauciones adecuadas para evitar la contaminación del experimentador y el entorno. Deshágase de todos los desechos siguiendo las directrices locales de seguridad radiológica. 1. Preparación de las células <ol><li> Células de semillas en 3,5 cm placas de tal manera que la confluencia alcanza el 80% -90% en el día de ensayo. <ol><li> Tenga en cuenta que la siembra de confluencia para las células depende del tipo celular y su tasa de crecimiento. Cuando el tratamiento de las células con un reactivo para un cierto número de días, semilla de células de modo que la confluencia es 80% -90% en el día de la medición de hemo. Si el número de células obtenido a partir de 3,5 cm placas es insuficiente, utilizar placas de 6 cm con la misma cantidad de ALA radiactivo como en el siguiente paso. Nota: El uso de placas individuales se recomienda porque es más fácil de manejar platos individuales. </li></ol></li><li> Un día antes de la medición hemo, añadir 0,1-0,3 Ci [14 C] 5-ALA y ALA frío para llegar a un final Concentración de 20 M del total ALA a cada placa de cultivo en un ataque área de trabajo para trabajar con materiales radiactivos y poner las placas de nuevo en la incubadora. Idealmente, se incuba con ALA radiactivo durante 16 horas. Nota: radiomarcado 5-ALA requiere puede variar entre líneas celulares. Se requiere un recuento radiactivo por minuto (cpm) de al menos 100 para reducir al mínimo el error asociado con el conteo. Es aconsejable para determinar una cantidad mínima de [14 C] 5-ALA requerida para las líneas celulares estudiadas. Para la mayoría de experimentos 0,1-0,3 Ci es suficiente para obtener una buena medición. La adición de frío ALA es opcional. </li></ol> 2. El hemo Extracción <ol><li> Coloque las placas de cultivo de células en hielo y llevarlos a la zona en condiciones de trabajar radiactividad. <ol><li> Realizar todo el proceso de extracción y evaporación en una campana a prueba de explosiones. Debido a que el éter almacenado puede explotar, utilizar el éter en pequeñas botellas y evaporar los líquidos restantes, no almacene en el éteruna botella abierta durante más de un mes. No utilice acetona cerca de llamas abiertas y calentadores, ya que es altamente inflamable. Acetona tienda que contiene reactivos en botellas de vidrio, ya que disuelve plástico de cultivo de tejidos. </li></ol></li><li> Aspirar el medio utilizando una pipeta. Lavar las células una vez con 1 ml de PBS 1x frío. Aspirar PBS. </li><li> Añadir 1 ml de PBS 1x frío a las placas y recoger las células en la parte inferior de la placa utilizando una goma de policía. Transferir las células recogidas de cada plato a un tubo ml preenfriado 2 etiquetados. Recoge todas las células en tubos de 2 ml. Nota: Utilice un policía de caucho fresco para cada placa para raspar las células de cada placa. Para cada placa que requeriría cuatro 2 ml tubos, un tubo de 1,5 ml y un vial de centelleo. </li><li> Centrifugado a 15.000 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Saque PBS utilizando una pipeta, dar un breve centrifugado y retire el PBS residual. Resuspender las células en 100 l de PBS 1x. Vortex para volver a suspender las células y mantener en hielo. </li><li> Tome 10 y# 956; l desde el paso 5 y la transferencia a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar en hielo para medir la concentración de proteínas. Nota: tampón de lisis celular, debe añadirse a las células y se mantuvo en hielo para medir la concentración de proteínas más tarde. </li><li> Haga girar los 90 l restantes de la etapa 5 a 5.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C; eliminar completamente PBS utilizando una punta de pipeta 200 l. </li><li> Añadir 300 l de tampón de extracción hemo (ver Lista de Materiales) a cada tubo. Entonces vórtice durante 15 segundos para mezclar y poner en hielo durante 1 min, repetir esto 3 veces. <ol><li> Añadir tampón de extracción hemo (HEB) y agitar el tubo rápidamente para volver a suspender el sedimento, hacer sólo una o dos tubos a la vez porque la pastilla debe resuspendió rápidamente sin quedarse en el HEB durante demasiado tiempo. Una vez HEB se añade a todos los tubos y sedimento se resuspende a continuación, siga el vórtice 15 seg y 1 min en el ciclo de hielo como en el paso 8. Nota pellet que puede no ir completamente en el HEB si la pastilla se deja en el tampón de HEB para una mástiempo y no se resuspendieron rápidamente. </li></ol></li><li> Añadir 1,2 ml de éter dietílico a cada tubo y agitar durante 30 seg. Centrifugado a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Nota: El éter dietílico se queda sin puntas de pipeta rápidamente. Para controlar esto, dietil éter pipeta arriba y abajo una vez o dos veces, haciendo así que ayuda a mantener el éter de dietilo en la pipeta. Repita esto cada vez que se utiliza una punta de pipeta nueva. </li><li> Transferencia de fase superior (éter) con 1 ml de la pipeta a un nuevo tubo de microcentrífuga. Añadir 0,5 ml de HCl 2 N, vórtice de mezclar y giro como en el paso 9. Nota: Es difícil ver la separación entre fases de éter y HCl. Por lo tanto, añadir pequeñas cantidades de azul tripán en solución de HCl 2 N para ser utilizado durante el experimento, lo suficiente como para darle un color azul pálido. Esto le ayudará a distinguir las dos fases. La fase inferior será azul y la fase etérea superior será incoloro. Transferir la fase etérea incoloro superior a un tubo nuevo y desechar la fase inferior HCl (azul). </li><li> Repita el paso 10 de dosmás veces para lavar la fase etérea con HCl 2 N. Transferir sólo la fase de éter arriba a un nuevo tubo durante cada repetición y desechar la fase inferior HCl. </li><li> Después del tercer lavado con HCl, transferir la fase superior con 1 ml de la pipeta a un vial de centelleo. Secar las muestras por evaporación del éter dietílico, manteniendo las muestras en la campana química O / N. </li></ol> 3. Medición de la radiactividad <ol><li> Al día siguiente, añadir 5 ml de líquido de centelleo de las muestras secas desde el paso 2.12. </li><li> Agitar bien para mezclar. Medir la radiactividad usando un contador de centelleo. </li></ol> 4. Cálculos <ol><li> Lisar las células del paso 2.6 utilizando la misma cantidad de tampón CelLytic M (ver Lista de Materiales) y centrifugado a 14.000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Tomar una alícuota del sobrenadante y medir la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteína BCA. La cantidad total de proteína en mg (TP) = (90 * l conc. De proteína en81; g / l) / 1000 Nivel de síntesis del grupo hemo (radiactividad / TP) = pmol / mg de proteína. </li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Heme juega un papel clave en la generación de energía celular a través de la respiración 26. El metabolismo del hemo Altered se sabe que está asociado con varias enfermedades, incluyendo el cáncer 28,41. La inhibición de la síntesis del grupo hemo se sabe que causa la detención del ciclo celular y la apoptosis en células HeLa 26,41. Se ha demostrado que el nivel de la síntesis de hemo alta se asocia con la progresión de las células de cáncer de pulmón 28. Por lo...

Hemo, un complejo de hierro ferroso y protoporfirina IX es una molécula central para el transporte y la utilización de oxígeno en los organismos que viven prácticamente todos 1-3. La estructura única de hemo le permite funcionar como un portador de gases diatómicos y electrones, así como para realizar diversas otras funciones 1-5. Por ejemplo, hemo se une al oxígeno en la hemoglobina y la mioglobina para la transferencia y el almacenamiento de 6,7 oxígeno. También funciona como un transportador de electrones en los citocromos durante la respiración y actúa como un donador de electrones para las reacciones redox catalizadas por enzimas del citocromo P450 8,9. Una de las características más significativas de hemo es que, puede desempeñar un papel regulador en los procesos celulares y moleculares, tales como la transcripción de genes, síntesis de proteínas y micro-ARN biogénesis 4. Por ejemplo, afecta a la transcripción de muchos genes mediante el control de la actividad de represor transcripcional de mamífero Bach1 y la rec nuclear de mamíferoeptor Rev-erbα 10-15. Heme regula la activación de la proteína activadora de hemo (Hap) 1 que desempeña un papel importante en la activación de genes implicados en la respiración y controlar el daño oxidativo, en respuesta a heme o de oxígeno 16. Heme también regula la transcripción de genes en las células neuronales a través de factor de crecimiento nervioso (NGF) de señalización 3,17-20. También regula la síntesis de proteínas en las células eritroides de mamífero mediante la modulación de la actividad de quinasa eIF2α hemo-regulados (HRI) 21-24. Además, hemo afecta a la actividad de las proteínas de señalización clave como la tirosina quinasa Src y Jak2, que son esenciales para el funcionamiento adecuado de las células y 4,20,25 crecimiento celular. Se encontró que en células HeLa inhibición heme provoca la detención del ciclo celular y la activación de marcadores asociados con la senescencia y apoptosis 26. Tanto la deficiencia de hemo o aumento de los niveles de hemo se asocian con efectos graves para la salud en los seres humanos 27. Recientes un molecularnd estudios epidemiológicos han mostrado una asociación positiva de alto consumo hemo y aumento del riesgo de enfermedades, tales como diabetes tipo 2, enfermedad coronaria y varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer colorrectal y cáncer de páncreas 27,28. El uso de un par emparejado de laboratorio de células pulmonares normales y cancerosas autores han encontrado que las células cancerosas se han incrementado los niveles de consumo de oxígeno, la síntesis del grupo hemo y proteínas implicadas en la captación de hemo y oxígeno utilización 28. Curiosamente, la inhibición de la síntesis de hemo disminuyó el consumo de oxígeno, la proliferación, la migración y la formación de colonias de células de cáncer 28. Por lo tanto, la fluctuación en los niveles de hemo endógeno juega un papel importante en la regulación de procesos moleculares y celulares 3,4,28,29. En los mamíferos, la biosíntesis de hemo se produce en ocho etapas, que implican enzimas localizadas en la mitocondria y el citosol 4 (Figura 1). Bios hemotesis comienza en la matriz de la mitocondria con la condensación de glicina y succinil-CoA reductasa para formar ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), catalizada por ALA sintasa (ALAS) 4,31. Este es el paso limitante en la biosíntesis de hemo en células no eritroides. 5-ALA entonces se exporta hacia el citosol, donde se producen los siguientes cuatro pasos para formar coproporfirinógeno III (CPgenIII), que luego se importa de nuevo a las mitocondrias, donde se convierte en la protoporfirina IX (PPIX). Finalmente, una molécula de hierro se incorpora a la protoporfirina IX (PPIX) para producir hemo, una reacción catalizada por ferroquelatasa (FECH) 2,4. El nivel de la biosíntesis de hemo depende principalmente del nivel de enzima ALAS que está estrechamente controlada por el hierro hemo intracelular y 4. La biosíntesis de hemo puede verse afectada por defectos genéticos, la disponibilidad de ciertos minerales y vitaminas (por ejemplo, riboflavina, zinc), la exposición a toxinas (por ejemplo, aluminio, plomo), Anoxia, fiebre, y los niveles de ciertos esteroides (por ejemplo, estrógeno) 32-35. El nivel de la síntesis de hemo se altera en diversas condiciones de enfermedad. Disminución de la biosíntesis del grupo hemo puede causar anemia, así como enfermedades neurológicas 3,36. Alternativamente, el aumento de la biosíntesis de hemo juega un papel importante en la progresión de ciertos cánceres 28,37. Heme ha demostrado ser crítico para el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de los mamíferos adiposo, eritroides y células neuronales 4,38-41. Por ejemplo, la deficiencia de hemo conduce a un daño de neuritas en neuronas corticales de ratón primaria a través de la inhibición de glutamato NMDA (N-metil-D-aspartato) receptor 17. Además, la inhibición de la síntesis de hemo causa la muerte celular programada en el carcinoma de cuello uterino humano epitelial células HeLa 26,41. Por lo tanto, la medición de los niveles de biosíntesis de hemo en diversas células bajo diferentes condiciones es importante para el estudio de la etiología y progressien de muchas enfermedades. Aquí se describe un método rápido y sensible para medir el nivel de la síntesis de hemo intracelular mediante el uso de [4- 14 C] de ácido 5-aminolevulic. Este es un método alternativo a otros métodos que utilizan 55 o 59 Fe Fe. Preferimos utilizando 14 C porque su radiación es muy débil. Por el contrario, se requiere una fuerte protección para trabajar con isótopos Fe. Además, este método está destinado a medir y comparar la síntesis de hemo en diferentes células en paralelo de una manera rápida. Con el fin de medir los niveles de hemo absolutos, se puede utilizar el método previamente establecido que implica el uso de HPLC 42,43.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Diethy ether</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>HCl (Hydrochloric acid)</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Scintillation cocktail&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>882470</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled 4-&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C aminolevulinic acid</td><td>Perkin-Elmer life sciences</td><td></td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CelLytic M</td><td>Sigma</td><td>C2978</td><td>Mammalian cell lysis reagent</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specific reagent&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Component&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Dispense&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Heme extraction buffer:&lt;br /&gt;Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)</td><td>Acetone&lt;br /&gt; Concentrated HCl&lt;br /&gt;Water</td><td>25 ml&lt;br /&gt;1.3 ml&lt;br /&gt;5 ml</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme sirve como el grupo prostético para una amplia variedad de proteínas conocidas como hemoproteínas, tales como hemoglobina, mioglobina y citocromos. Está implicada en diversos procesos moleculares y celulares, tales como la transcripción de genes, la traducción, la diferenciación celular y la proliferación celular. Los niveles de biosíntesis de hemo varía en los diferentes tejidos y tipos de células y se alteran en condiciones de enfermedad como la anemia, neuropatía y el cáncer. Esta técnica utiliza [4- 14 C] de ácido 5-aminolevulínico ([14 C] 5-ALA), uno de los primeros precursores en la ruta de biosíntesis de hemo para medir los niveles de síntesis de hemo en células de mamífero. Este ensayo implica la incubación de las células con [14 C] 5-ALA seguido de la extracción de hemo y la medición de la radiactividad incorporada en hemo. Este procedimiento es precisa y rápida. Este método mide los niveles relativos de la biosíntesis del grupo hemo, más que el contenido total de hemo. Para demostrar el uso de esta technIQUE los niveles de biosíntesis de hemo se midieron en varias líneas celulares de mamíferos.

Este método se utilizó para comparar los niveles de síntesis de hemo en normal (HBEC30KT) vs. cáncer (HCC4017 células pulmonares). La Figura 2 muestra un nivel más alto de la síntesis de hemo en células de cáncer (HCC4017) que las células pulmonares normales (HBEC30KT). El nivel de la síntesis de hemo también se midió en células normales y cancerosas en la presencia de cianuro de carbonilo desacoplador mitocondrial 3-clorofenilhidrazona (CCCP). Las células fueron tratadas con CCCP 10 mM d...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K vistas.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

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Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

Síntesis y rendimiento catalítico de Oro intercalados en las Murallas de sílice mesoporoso

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

Investigación

Química

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Bioquímica

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Inmunología e Infección

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biología

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Bioingeniería

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The use of experimental animal models of iron overload or deficiency has been instrumental to advance knowledge of the mechanisms involved in the systemic and cellular regulation of iron homeostasis. The measurement of total iron levels in animal tissues is commonly performed with atomic absorption spectroscopy or with a colorimetric assay based on the reaction of non-heme iron with a bathophenanthroline reagent. For many years, the colorimetric assay has been used for the measurement of the non-heme iron content in a wide range of animal tissues. Unlike atomic absorption spectroscopy, it excludes the contribution of heme iron derived from hemoglobin contained in red blood cells. Moreover, it does not require sophisticated analytical skills or highly expensive equipment, and can thus be easily implemented in most laboratories. Finally, the colorimetric assay can be either cuvette-based or adapted to a microplate format, allowing higher sample throughput. The present work provides a well-established protocol that is suited for the detection of alterations in tissue iron levels in a variety of experimental animal models of iron overload or iron deficiency.

Here, a protocol for the measurement of the non-heme iron content in animal tissues is provided, using a simple, well-established colorimetric assay that can be easily implemented in most laboratories.

Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Medicina

Cuantificación de la modificación de histonas en el cerebro del ratón mediante citometría de flujo

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

Autor destacado: Mejoras en la investigación de la regulación de la expresión génica

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

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Resumen

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