Este método se basa en los protocolos de alcance calificados de ratas establecidos para automatizar el entrenamiento y las pruebas, proporcionando un medio eficiente para adquirir grandes conjuntos de datos relativamente rápidamente. Minimiza el esfuerzo del experimentador al tiempo que permite la reconstrucción tridimensional de la cinemática de la extremidad delantera. La cinemática se puede utilizar para evaluar los efectos de intervenciones cronopesadas con precisión o correlacionadas con grabaciones fisiológicas.
Con algunos ajustes, esta técnica también se puede aplicar en ratones. Comience encendiendo las luces y coloque la rata en una cámara de alcance hábil. Use fórceps para sostener un pellet a través de la ranura de alcance en la parte delantera de la caja.
Deje que la rata coma tres perdigones de los fórceps. Tire del pellet hacia atrás la próxima vez que la rata intente comer el pellet de los fórceps y repita hasta que la rata alcance el pellet con una pata como máximo de 11 alcances que indiquen la preferencia de la pata. A continuación, alinee la varilla de entrega de pellets con el lado de la ranura de alcance contralateral a la pata preferida de la rata.
Coloque un pellet en la barra de entrega. A continuación, utilice fórceps para cebar a la rata con el pellet, pero dirigir la rata hacia la barra de entrega para que su pata golpea el pellet en la varilla. Después de que la rata ha intentado 10 llegar a la barra de entrega sin ser cebado, avanzar la rata a la siguiente fase.
A continuación, coloque la varilla de entrega de pellets en función de la preferencia de la pata de la rata y establézcala en la posición dos. Ajuste la posición de altura de la varilla de entrega de pellets utilizando el mando a distancia del actuador. Una vez que la barra de entrega esté a la altura correcta, mantenga pulsado el número deseado hasta que la luz parpadee en rojo para ajustar.
A continuación, coloque la rata en la cámara y cebo la rata en la parte posterior con un pellet. Cuando la rata se mueve lo suficientemente lejos a la parte posterior de la cámara que rompería el haz infrarrojo si la versión automatizada estaba funcionando, mueva la barra de entrega de pellets a la posición tres. Finalmente, espere a que la rata alcance el pellet y luego mueva la varilla de entrega de pellets de nuevo a la posición dos.
Coloque un pellet nuevo en la barra de entrega si se derriba. Repita estos pasos gradualmente cebando a la rata cada vez menos hasta que la rata comience a uno, muévase a la parte posterior para solicitar un pellet sin ser cebado, y dos, inmediatamente se mueven al frente después de solicitar un pellet en la parte posterior. Después de que la rata haya hecho esto 10 veces, comience a entrenar en la tarea automatizada.
Para configurar el sistema automatizado, encienda las luces de la cámara y rellene el depósito de pellets. Coloque la varilla de entrega de pellets de acuerdo con la preferencia de la pata de la rata. Compruebe que las posiciones del actuador estén configuradas correctamente.
A continuación, encienda el ordenador y abra el programa de alcance experto. Introduzca el número de identificación de la rata en el asunto y seleccione la preferencia de la pata en el menú desplegable de la mano. Especifique la ruta de guardado de los vídeos.
A continuación, establezca la hora de la sesión y el número de vídeos máximos. Establezca la duración de la elevación de pellets también y habilite la penalización de alcance temprano. A continuación, para tomar imágenes de calibración, coloque la mano de ayuda dentro de la cámara de alcance y atorle el clip del caimán a través de la ranura de alcance.
Sostenga el cubo delante de la ranura de alcance con el clip de cocodrilo. A continuación, coloque el cubo de modo que el lado rojo aparezca en el espejo superior, el lado verde en el espejo izquierdo y el lado azul en el espejo derecho. En el programa de comportamiento, asegúrese de que el umbral de ROI se establece en un valor muy grande.
Haga clic en el botón de ejecución y una vez que el botón inicializado de la cámara se vuelva verde, pulse Start para comenzar la adquisición de vídeo. Haga clic en Modo Cal y, a continuación, haga clic en Tomar imagen de Cal. Mueva el cubo ligeramente y tome otra imagen.
Repita de nuevo para un total de tres imágenes. Por último, detenga el programa haciendo clic en Detener y, a continuación, haga clic en el botón detener signo. Retire la mano de ayuda y el cubo de la caja.
Tenga cuidado de no golpear nada en la cámara de comportamiento después de que se hayan tomado las imágenes de calibración ese día. Primero, coloca a la rata en la cámara de alcance hábil. Haga clic en la flecha blanca para ejecutar el programa.
A continuación, establezca la posición del ROI para la detección de patas ajustando x offset, y offset, ROI width y ROI height. Coloque el ROI en el espejo lateral que muestra el dorso de la pata directamente delante de la ranura de alcance y haga clic en comenzar para comenzar el programa. Mientras la rata no está alcanzando, ajuste el valor de umbral de ROI bajo hasta que el valor de activación de ROI vivo esté oscilando entre cero y uno.
A continuación, establezca el umbral de ROI para que sea significativamente mayor que el valor de activación de ROI en vivo durante los golpes de nariz y inferior al valor de activación de ROI en vivo cuando la rata alcanza. Ajuste hasta que los videos se activen constantemente cuando la rata llegue, pero no cuando se mete la nariz a través de la ranura. Supervise las primeras pruebas para asegurarse de que todo funciona correctamente.
Cuando una rata llega antes de solicitar un pellet, observe el aumento del número de los primeros alcances. Cuando una rata llega después de solicitar un pellet, observe el número de videos aumentar mientras una copia del video se guarda como un archivo bin. Finalmente, después de alcanzar el tiempo de sesión o el número máximo de videos, pulse el botón de detener la señal.
Los resultados indican que después de 20 días, las ratas adquieren la tarea de alcance experto. Aquí, se muestran las trayectorias de alcance de una sola sesión. Esto representa sólo el avance inicial de la pata para facilitar la presentación.
Además, si el gatillo de detección de patas no se establece con precisión, hay una variabilidad significativa en el marco en el que la pata rompe la ranura de alcance que puede conducir a la variabilidad en cuando las intervenciones se activan durante los movimientos de alcance. Aparte de un manejo cuidadoso de los animales, no se tomarán precauciones en este protocolo. Es más importante establecer el umbral de ROI correctamente para que los vídeos u otras intervenciones se activen en los momentos adecuados.
Este método se puede combinar con varias otras técnicas como la optogenética, la imagen de calcio y los modelos genéticos que pueden abordar preguntas que van desde el control motor básico hasta la fisiopatología del trastorno del movimiento. Esta técnica permite la correlación de la cinemática detallada de alcance y agarre con grabaciones fisiológicas o intervenciones que permiten a los investigadores responder no sólo si, sino cómo cambian los movimientos con los circuitos neuronales.
