La disección de la retina del ratón es un proceso muy delicado debido al tamaño y la forma de los ojos y la fragilidad de la sección de la retina. Imperativo para la práctica, tener un protocolo detallado que proporcione un método y consejos eficientes es la clave para la disección y sección de la retina de alta calidad. Proporcionamos consejos y consejos para ayudar a los investigadores a evitar escollos comunes y obtener algunas secciones de retina de alta calidad adecuadas para la inmunohistoquímica.
Marque la parte temporal del ojo de un ratón eutanizado usando un cauterizador de cola tocando la córnea muy ligeramente y durante no más de una fracción de segundo para quemar ligeramente la córnea y evitar hacer un agujero. Inmediatamente después se utilizó púas curvadas Dumont 545 para enuclear los ojos del ratón. Coloque los ojos en un criotubo de 1,5 mililitros con un mililitro de 4%PFA y PBS e incubar durante 15 minutos sobre hielo.
Luego, transfiera los ojos fijos usando los fórceps curvos Dumont 545 a una placa de disección de 35 milímetros modificada llena de PBS y colóquelas bajo microscopio de disección. Utilice una microknife para hacer una pequeña incisión en la marca de quemadura perpendicular y justo por encima del borde del limbo de la córnea. Inserte tijeras curvas en la incisión y realice un corte circunferencial de la córnea después del limbo.
Luego, usando fórceps delgados de Dumont 5, retire la córnea, extraiga la lente y levántela delicadamente lejos de la parte posterior del ojo. El cuerpo vítreo saldrá con la lente y la retina será visible como una superficie blanca que cubre el interior de la copa del ojo posterior. Lave las copas de los ojos aisladas dos veces en un mililitro de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Para proteger las copas de los ojos, equilibrelas en 15% de sacarosa y PBS durante la noche a cuatro grados centígrados hasta que se hundan. Luego transfiera las copas de los ojos a 30%sucrose y PBS durante dos a tres horas hasta que se hundan. Coloque las copas de los ojos en OCT en criomoldeos de 10 por 10 milímetros para incrustar.
Bajo un microscopio diseccionador, oriente el ojo en el criomodo a lo largo de su eje ventral dorsal girando el ojo hasta que la marca de quemadura esté en la parte superior. El nervio óptico es uno a la izquierda y la parte cortada del molde mira hacia la derecha. Para congelar el tejido de la retina, sumerja el criomodo durante al menos cinco minutos en un vaso de precipitados metálicos que contenga isopentano y luego coloque el vaso de precipitados en nitrógeno líquido hasta un tercio de la altura del vaso de precipitados.
Retire el bloque congelado, envuélvalo en papel de aluminio y guárdelo a menos 80 grados Centígrados. Utilice un bolígrafo o Sharpie para marcar el bloque congelado para registrar su orientación. Después de ajustar la temperatura del criostato entre menos 20 y menos 25 grados Celsius, coloque los moldes que contienen las copas de los ojos incrustadas en el interior y permita que se equilibren a la temperatura del criostato durante una hora.
Instale el bloque en el criostato con la orientación ventral dorsal y comience a cortar secciones seriales de 10 micrómetros de espesor. Coloque cuidadosamente las secciones de la retina en diapositivas de microscopio anotadas y numeradas y luego guárdelas a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para la inmunosudera. Inmunohistoquímica con anticuerpos contra la rodopsina, un marcador de fotorreceptor, descarboxilasa 65 de ácido glutámico y marcador de células de amacrina, sintetasa de glutamina y marcador celular Muller, y calbindina, un marcador celular horizontal en secciones de la retina.
Los resultados indican que este protocolo produce secciones de retina de alta calidad y bien conservadas a diferencia de las secciones de retina de mala calidad obtenidas de un protocolo diferente. Los segmentos internos y externos ricos de Rhodopsin permanecen verticales e intactos con poca o ninguna separación del epitelio pigmentado de la retina. Las interneuriones, como las células de amacrina positivas Gad65, permanecen correctamente estratificadas dentro de la capa nuclear interna y la capa plexiforme interna.
Además, las células De Muller permanecen bien conservadas con soma correctamente alineado en procesos citoplasmáticos que abarcan desde la capa celular ganglionar hasta la capa nuclear externa. Además, las células horizontales bien definidas son detectables en la capa nuclear interna y el borde exterior de la capa plexiforme. Es importante marcar la región topper de los ojos y mantener la orientación durante la incrustación.
Prepare siempre el paraformaldehído bajo el capó con el equipo de protección personal adecuado.
