小鼠视网膜冷冻节的制备,用于免疫性植物化学

由于眼睛的大小和形状以及视网膜部分的脆弱性，小鼠视网膜解剖是一个非常微妙的过程。实践势在必行，有一个详细的协议，提供有效的方法和提示是高品质的视网膜解剖和部分的关键。我们提供提示和建议，以帮助研究人员避免常见的陷阱，并获得一些高品质的视网膜部分适合免疫组织化学。

使用尾烧灼伤器轻轻触摸角膜，用一瞬间轻轻触摸被安乐死小鼠的眼睛的时间部分，以稍微灼伤角膜，避免打洞。紧接着，使用弯曲的杜蒙545钳子，以羡慕老鼠的眼睛。将眼睛放在1.5毫升的冷冻管中，用1毫升4%PFA和PBS，在冰上孵育15分钟。

然后，使用弯曲的Dumont 545钳子将固定的眼睛转移到一个经过修饰的35毫米解剖盘上，里面装满了PBS，并放在解剖显微镜下。使用微刀在垂直于角膜边缘边缘的烧伤标记上做一个小切口。将弯曲的剪刀插入切口，并在边缘后对角膜进行圆周切割。

然后，使用薄的Dumont 5钳子，取出角膜，提取透镜，并小心翼翼地将其从眼睛的后部提起。玻璃体会与透镜一起出来，视网膜将可见为覆盖后眼杯内侧的白色表面。在室温下将隔离眼罩在一毫升 PBS 中清洗两次，10 分钟。

要冷冻保护眼罩，在4摄氏度下将眼杯在15%蔗糖和PBS中平衡，直到它们下沉。然后将眼罩转移到30%蔗糖和PBS两到三个小时，直到它们下沉。将眼罩放在 10 百万分之一或 10 毫米低温模具中，用于嵌入。

在解剖显微镜下，通过旋转眼睛，将低温模具中的眼睛沿着侧腹轴定向，直到烧伤标记位于顶部。视神经是左边的神经，模子的切口部分朝右。要捕捉冷冻视网膜组织，将低温模具浸入含有异丙烷的金属烧杯中至少五分钟，然后将烧杯放在液氮中，达到烧杯高度的三分之一。

取出冷冻块，用铝箔包裹，储存在零下80摄氏度。使用笔或夏皮标记冻结块以记录其方向。将低温恒温调整到零下 20 至零下 25 摄氏度之间后，将含有嵌入眼罩的模具放在里面，让其与低温温度均衡一小时。

将块安装到低温恒温器中，并带后腹方向，开始切割 10 微米厚的串行截面。小心地将视网膜部分放在带注释和编号的显微镜幻灯片上，然后存放在零下 20 摄氏度或零下 80 摄氏度的幻灯片盒中，直到准备好进行免疫破坏。免疫hito化学与抗体的罗多普辛，光受体标记，谷氨酸脱卡盒酶65，和阿马克林细胞标记，谷氨酰胺合成和穆勒细胞标记，和卡宾丁，在视网膜部分执行水平细胞标记。

结果表明，该协议产生高质量和保存完好的视网膜部分，不同于从不同协议获得的劣质视网膜部分。富含罗多普辛丰富的内层和外段保持垂直和完好，很少或没有分离，从覆盖视网膜色素上皮。内部肿瘤，如Gad65正阿马克林细胞，保持适当的分层内核层和内层。

此外，穆勒细胞在从结节细胞层到外核层的细胞质过程中，与索马正确对齐，保存完好。此外，在内部核层和外层边界上可检测到定义良好的水平细胞。标记眼睛的顶点区域并在嵌入过程中保持方向非常重要。

始终使用适当的个人防护设备在引擎盖下准备半甲醛。