Nuestros protocolos proporcionan un punto de partida para estudios funcionales de desarrollo de lentes y fisiología y para el cribado genético inverso de fenotipos de lentes en peces cebra. Nuestros protocolos puentean los análisis in vitro e in vivo de la morfología de la membrana de la lente de pez cebra y proporcionan un método nuevo y sencillo para cuantificar el desarrollo de la óptica de lentes de pez cebra. El análisis de la morfología y la óptica de las lentes de pez cebra conduce a la información sobre los mecanismos que controlan el desarrollo de lentes, la fisiología normal y la fisiopatología.
Estos conocimientos pueden a su vez conducir a la capacidad de retrasar o prevenir la catarata. No ha habido informes en especies que no sean peces cebra de núcleos de lentes localizados asimétricamente. La identificación de las suturas de lente es fundamental para orientar correctamente la lente para medir la localización del núcleo.
Después de la confirmación de la sedación suficiente con Tricaine, utilice tijeras de microdisección para extirpar inmediatamente ambos ojos de un pez cebra adulto o larval y coloque ambos ojos en un plato Petri hecho a medida de 35 milímetros con un molde de disección de silicona lleno de PBS. Para cosechar la lente de un pez cebra adulto, coloque el lado posterior del ojo hacia arriba e inserte los fórceps en un ángulo inferior a 45 grados a través del disco óptico. Utilice tijeras de disección para hacer dos o tres incisiones radiales a través de la retina y la esclerótica desde el disco óptico hasta la zona ciliar en el ojo inmovilizado y pelar la retina y la esclerótica como pétalos de flores.
Invierta el ojo, el lado de la córnea hacia arriba, y use el lado plano de las tijeras para inmovilizar la lente indirectamente a través de la manipulación de la esclerótica y la córnea mediante el uso de fórceps para alejar la retina y los tejidos unidos, luego recorte cuidadosamente cualquier exceso de tejido de la lente. Para la cosecha de lentes de pez cebra larval, coloque un lado posterior del ojo larval hacia arriba en la parte plana de una placa de silicona de PBS y use una aguja de tungsteno afilada para hacer cortes radiales a través de la retina y la esclerótica mientras inmoviliza el ojo con otra aguja o fórceps, luego retire suavemente la lente del ojo disociado con el lado romo de una aguja de alambre de tungsteno hecha a medida y retire cuidadosamente el tejido conectado. Para medir la localización del núcleo de la lente del eje anterior-posterior, oriente las lentes recién extirpadas axialmente en PBS en un plato de 35 milímetros con un fondo de cristal de cubierta con los polos y suturas orientados paralelos al plano de enfoque.
Para identificar el núcleo de la lente, busque una diferencia en el índice de refracción, que generalmente ocurre en la interfaz de la corteza de la lente y el núcleo de la lente. Si las suturas de lente no son evidentes, un ligero lamedura con fórceps a la cápsula de la lente revela las suturas y el núcleo de la lente, ayudando a orientar la lente para la medición. Coloque el plato en el escenario de un microscopio de disección equipado con una cámara e imagen de las lentes con el núcleo de la lente en foco bajo iluminación de campo brillante o con óptica de contraste de interferencia diferencial.
Imagen de un micrómetro bajo el mismo aumento para la calibración y haga clic en Vista en vivo. Haga clic en Instantánea para obtener una imagen y guardar la imagen como un archivo TIFF. Para calibrar las imágenes de lente adquiridas, en un programa de software de procesamiento de imágenes adecuado, seleccione la herramienta de línea recta y dibuje una línea de longitud conocida en la imagen del micrómetro.
Haga clic en Analizar y establecer escala e introduzca la distancia y las unidades conocidas, seleccione Calibración global y haga clic en Aceptar. Para medir la distancia desde el centro del núcleo de la lente hasta el polo anterior, identifique la ubicación de la sutura de lente y utilice la herramienta de línea recta para dibujar una línea a través del centro de la lente en una orientación axial. El centro de esta línea es el centro del núcleo de la lente. Dibuje otra línea desde este punto hasta el polo anterior de la lente y seleccione Medir en el menú Analizar para medir la distancia.
Dibuje otra línea desde el polo anterior hasta el polo posterior y mida esta distancia como el diámetro de la lente, luego copie estas longitudes desde la ventana Resultados a una hoja de cálculo y calcule la localización normalizada del núcleo de la lente con respecto al radio de la lente. Durante tres días después de la fertilización, se forman suturas anteriores en el polo anterior y la sorprendente convergencia de las células se visualiza claramente mediante la tinción de faloideína de las membranas celulares de fibra estrecha en embriones fijos. El etiquetado de células de fibra ancha más fuerte en la membrana de la lente localizada mApple transgenic permite la visualización en vivo de subdominios de membrana, pero carece de la convergencia sutural.
Las suturas posteriores se pueden visualizar tanto in vitro como in vivo a los tres días después de la fertilización. En un plano ecuatorial, la faloideína etiqueta fuertemente las células externas de fibra cortical, revelando una forma hexagonal aplanada. La phalloidina está excluida del núcleo de la lente compactada y el tipo salvaje y la lente mutante se ven indistinguibles.
El fuerte etiquetado de células de fibra ancha en mosaicos mApple localizados por membrana de lente transgénicos revelan interrupciones en el volumen celular dentro de la lente mutante. Como la expresión transgénica no está limitada por la permeabilidad, algunos mosaicos revelan el etiquetado del núcleo de la lente. En animales de tipo salvaje, el núcleo de la lente comienza más cerca del polo de la lente anterior durante las primeras etapas de desarrollo antes de centralizarse durante la edad adulta.
La expresión de proteínas etiquetadas en verde en un huésped transgénico en el que las membranas celulares de color rojo permite la localización simultánea de proteínas, así como la evaluación de la morfología de las células de fibra in vivo. Los peces cebra son especialmente adecuados para estudios in vivo. Usando las herramientas descritas aquí, podemos sondear mecanismos de lentes, ampliamente estudiados in vitro, en un sistema in vivo.
