Unsere Protokolle bieten einen Ausgangspunkt für funktionelle Studien zur Linsenentwicklung und Physiologie sowie für das umgekehrte genetische Screening von Linsenphänotypen in Zebrafischen. Unsere Protokolle überbrücken In-vitro- und In-vivo-Analysen der Morphologie der Zebrafischlinsenmembran und bieten eine neue und einfache Methode zur Quantifizierung der Entwicklung von Zebrafischlinsenoptiken. Die Analyse der Morphologie und Optik von Zebrafischlinsen führt zu Erkenntnissen über Mechanismen zur Steuerung der Linsenentwicklung, der normalen Physiologie und der Pathophysiologie.
Diese Erkenntnisse können wiederum zu einer Fähigkeit führen, Katarakt zu verzögern oder zu verhindern. Es gab keine Berichte über andere Arten als Zebrafische asymmetrisch lokalisierter Linsenkerne. Das Identifizieren von Linsennähten ist entscheidend für die korrekte Ausrichtung der Linse, um die Kernlokalisierung zu messen.
Nach Bestätigung einer ausreichenden Sedierung mit Tricaine verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um beide Augen entweder von einem Erwachsenen oder einem Larvenzebrafisch sofort zu verbrauchen und beide Augen in eine 35-Millimeter-Petrischale mit einer mit PBS gefüllten Silikon-Sektionsform zu legen. Um die Linse von einem erwachsenen Zebrafisch zu ernten, legen Sie das Auge hintere Seite nach oben und setzen Sie Zangen in einem Weniger als 45-Grad-Winkel durch die optische Scheibe ein. Verwenden Sie Eine Sezierschere, um zwei oder drei radiale Einschnitte durch die Netzhaut und Sklera von der optischen Scheibe in die Ziliarzone im immobilisierten Auge zu machen und die Netzhaut und Sklera wie Blütenblätter zu schälen.
Invertieren Sie das Auge, Hornhautseite nach oben, und verwenden Sie die flache Seite der Schere, um die Linse indirekt durch Manipulation der Sklera und Hornhaut durch die Verwendung von Zangen zu immobilisieren, um die Netzhaut und das angehängte Gewebe wegzuziehen, und schneiden Sie dann sorgfältig überschüssiges Gewebe von der Linse weg. Für Larven Zebrafisch-Objektiv Ernte, legen Sie ein Larvenauge hintere Seite auf den flachen Teil einer Silikonschale von PBS und verwenden Sie eine geschärfte Wolframnadel, um radiale Schnitte durch die Netzhaut und Sklera zu machen, während das Auge mit einer anderen Nadel oder Zange immobilisieren, dann schaufeln Sie die Linse vorsichtig aus dem dissoziierten Auge mit der stumpfen Seite einer maßgeschneiderten Wolfram-Draht-Nadel und ziehen Sie vorsichtig weg. Um die vordere-posterior E-Achsen-Linsenkernlokalisierung zu messen, orientieren Sie die frisch geschnittenen Linsen axial in PBS in einer 35-Millimeter-Schale mit einem Abdeckungsglasboden mit den Parallelen und Nähten, die parallel zur Fokusebene ausgerichtet sind.
Um den Linsenkern zu identifizieren, suchen Sie nach einem Unterschied im Brechungsindex, der normalerweise an der Schnittstelle des Linsenrinden und des Linsenkerns auftritt. Wenn Linsennähte nicht erkennbar sind, zeigt ein leichtes Leck enden mit Zangen zur Linsenkapsel die Nähte und den Linsenkern und hilft, die Linse für die Messung zu orientieren. Stellen Sie die Schale auf die Bühne eines mit einer Kamera ausgestatteten Seziermikroskops und fotografieren Sie die Linsen mit dem Linsenkern im Fokus unter HellerFeldbeleuchtung oder mit Differentialinterferenzkontrastoptik.
Zeigen Sie ein Mikrometer unter derselben Vergrößerung für die Kalibrierung ab und klicken Sie auf Live View. Klicken Sie auf Snapshot, um ein Bild abzuspeichern und das Bild als TIFF-Datei zu speichern. Um die erfassten Objektivbilder zu kalibrieren, wählen Sie in einem geeigneten Bildverarbeitungssoftwareprogramm das gerade Linienwerkzeug aus und zeichnen Sie eine Linie bekannter Länge auf dem Mikrometerbild.
Klicken Sie auf Analysieren und Skalieren festlegen, und geben Sie die bekannte Entfernung und Einheiten ein, wählen Sie dann Globale Kalibrierung und klicken Sie auf OK. Um den Abstand vom Zentrum des Linsenkerns zum vorderen Pol zu messen, identifizieren Sie die Position der Linsennaht und verwenden Sie das gerade Linienwerkzeug, um eine Linie über den abgebildeten Mittelpunkt des Linsenkerns in axialer Ausrichtung zu zeichnen. Die Mitte dieser Linie ist die Mitte des Linsenkerns. Zeichnen Sie eine weitere Linie von diesem Punkt zum vorderen Pol der Linse, und wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messen aus, um den Abstand zu messen.
Zeichnen Sie eine andere Linie vom vorderen Pol zum hinteren Pol und messen Sie diesen Abstand als Linsendurchmesser, kopieren Sie diese Längen dann aus dem Ergebnisfenster in eine Tabelle und berechnen Sie die normalisierte Lokalisierung des Linsenkerns in Bezug auf den Linsenradius. Durch drei Tage nach der Befruchtung bilden sich an der vorderen Stelle vordere Nähte und die markante Konvergenz der Zellen wird durch Phalloidin-Färbung der schmalen Faserzellmembranen in festen Embryonen deutlich visualisiert. Eine stärkere Breitfaser-Zellbeschriftung in der Linsenmembran lokalisiert mApple transgenic ermöglicht eine Live-Visualisierung von Membransubdomains, aber es fehlt die suturale Konvergenz.
Hintere Nähte können sowohl in vitro als auch in vivo an drei Tagen nach der Befruchtung visualisiert werden. In einer äquatorialen Ebene beschriftet Phalloidin die äußeren kortikalen Faserzellen stark und zeigt eine abgeflachte sechseckige Form. Phalloidin ist vom verdichteten Linsenkern ausgeschlossen und Wildtyp und mutierte Linse sehen nicht zu unterscheiden.
Die starke Kennzeichnung von breiten Faserzellen in linsenmembranlokalisierten mApple-Mosaiken transgenen zeigen Störungen des Zellvolumens innerhalb der mutierten Linse. Da die transgene Expression nicht durch Durchlässigkeit eingeschränkt ist, offenbaren einige Mosaike die Linsenkernbeschriftung. Bei Wildtieren beginnt der Linsenkern in den frühen Entwicklungsstadien näher am vorderen Linsenpol, bevor er sich im Erwachsenenalter zentralisiert.
Die Expression von grün getaggten Proteinen in einem transgenen Wirt, in dem die Zellmembranen Fluoreszenrot fluoreszierend, ermöglicht die gleichzeitige Proteinlokalisierung sowie die Beurteilung der Faserzellmorphologie in vivo. Zebrafische eignen sich besonders gut für In-vivo-Studien. Mit den hier beschriebenen Werkzeugen können wir Linsenmechanismen, die größtenteils in vitro untersucht wurden, in einem In-vivo-System untersuchen.
