Aquí, hemos establecido un sistema experimental simple que permite la reconstitución de complejos activos de alargamiento Pol II adecuados para investigar el acoplamiento funcional de la transcripción de Pol II y el taponamiento de ARN. Con este método, los complejos de alargamiento funcional se pueden montar fácilmente con solo unos pocos componentes. Los complejos de alargamiento están inmovilizados en cuentas magnéticas, por lo que es fácil cambiar las condiciones de reacción.
Para inmovilizar el oligo de ADN que contiene biotina en cuentas magnéticas, primero agregue 200 microlitros de cuentas magnéticas a un tubo de 1,5 mililitros de unión a proteínas bajas, y luego coloque el tubo en un bastidor magnético durante dos minutos. Mientras el tubo está en el bastidor magnético, utilice una pipeta para extraer el líquido del tubo sin alterar las perlas. Para lavar las perlas, retire el tubo del bastidor y agregue un mililitro de tampón de lavado que contenga trishidloruro, EDTA y cloruro de sodio.
Vuelva a colocar el tubo en el bastidor. Después de dos minutos, retire la solución de lavado y repita los lavados dos veces más con 200 microlitros del mismo tampón. Resuspender las perlas magnéticas en 400 microlitros de tampón 2X.
A continuación, agregue 380 microlitros de agua y 20 microlitros de oligo de ADN biotinilado de 10 micromolares no plantillas para mezclar. Coloque el tubo en un encarioador e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, lave las perlas con oligo de ADN inmovilizado no plantilla tres veces usando 200 microlitros de tampón y luego tres veces con 200 microlitros de almacenamiento y tampón de dilución.
Almacene el tubo a cuatro grados centígrados durante la noche para terminar de bloquear las perlas con BSA. Al día siguiente, desechar la solución, resuspender las perlas en 200 microlitros de almacenamiento y tampón de dilución, para alcanzar una concentración aproximada de ADN de cinco micromolares, y luego transferir la solución con las perlas a un nuevo tubo. Para obtener el dúplex DNA-ARN, prepare una mezcla de recocido de 10 microlitros en un tubo pcR con una relación molar de ARN-ADN de dos a uno, como se describe en el protocolo escrito.
Coloque el tubo en un ciclor térmico. Ajuste el programa a 45 grados centígrados durante cinco minutos, seguido de 12 ciclos de dos minutos cada uno, comenzando en 43 grados Celsius y disminuyendo la temperatura en dos grados Celsius por ciclo. Por último, manténgalo inactivo a cuatro grados centígrados.
Para cargar ARN polimerasa II purificado en el híbrido DNA-RNA, mezcle un microlitros de dúplex DNA-ARN con 13 microlitros de tampón de polimerasa II recién preparados en un tubo. Agregue un microlitro de ARN polimerasa PURIFICAdo II, y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y revolviendo con la punta de la pipeta, sin introducir burbujas. Incubar el tubo durante 10 minutos a 30 grados centígrados.
Para completar el complejo de alargamiento, agregue un microlitro de cuentas de oligos de ADN no plantillas inmovilizadas a 14 microlitros de tampón de ADN no plantillas, agregue la mezcla de 15 microlitros al tubo previamente incubado e ilicíquela durante otros 10 minutos a 37 grados centígrados. Coloque la muestra en el bastidor magnético durante dos minutos. Lave la muestra una vez con 30 microlitros de tampón de lavado para eliminar la polimerasa NO incorporada II y los oligos.
Para radioetiquetar los complejos de alargamiento con ARN 23mermers, agregue un microlitros de ATP y un microlitros de UTP radiomarcado a 23 microlitros de tampón de pulso, y agregue esta mezcla a las cuentas magnéticas lavadas para resuspender. Incubar la reacción durante 10 minutos para permitir la síntesis de 23mermers radiomarcados. Añadir 1,5 microlitros de solución que contengan 100 micromolares DE ATP y mezcla de UTP de 100 micromolares a 3,5 microlitros de tampón de persecución, y añadir la mezcla al tubo que contiene complejos de alargamiento premontados en perlas.
Una vez más, incuba el tubo durante cinco minutos para perseguir todas las transcripciones nacientes en 23mers. A continuación, coloque el tubo en el bastidor magnético y lave como se hizo anteriormente para eliminar los nucleótidos no incorporados. Resuspender la muestra en 30 microlitros de tampón de lavado.
Para generar complejos de alargamiento con transcripciones más largas, siga los procedimientos anteriores y escale cuatro veces para generar 120 microlitros de complejos de alargamiento lavados para cuatro reacciones. Etiquete tres tubos nuevos 23mer, 25mer y 29mer. Transfiera 30 microlitros de complejos de alargamiento lavados al tubo de 23mer, y agregue 94 microlitros de mezcla de parada que contengan proteinasa K y glucógeno.
Coloque el tubo que contiene los 90 microlitros restantes de complejos de alargamiento lavados en el bastidor magnético durante dos minutos, retire el sobrenadante y resuspend perlas en 90 microlitros de BTB complementados con 1,2 microlitros de ATP y CTP. Incubar durante 10 minutos a 30 grados centígrados. Después de lavar con 90 microlitros de tampón de lavado, transfiera 30 microlitros de complejos de alargamiento al tubo de 25mer, y agregue 94 microlitros de mezcla de parada que contengan proteinasa K y glucógeno.
Una vez más, coloque el tubo que contiene los 60 microlitros restantes de complejos de alargamiento en el bastidor magnético durante dos minutos. Repita el tratamiento BTB con 60 microlitros de tampón complementados con 0,8 microlitros de ATP y CTP. Después de la incubación y lavado como se hizo antes, resuspender la muestra en 60 microlitros de tampón de lavado.
Transfiera 30 microlitros de la muestra al tubo de 29mer, y agregue 94 microlitros de mezcla de parada que contengan proteinasa K y glucógeno. Analizar los productos de reacción en un gel de poliacrilamida desnaturalnativo. En primer lugar, generar complejos de alargamiento lavado que contengan 23mermers ampliando 13 veces el procedimiento descrito anteriormente para obtener 390 microlitros para 12 reacciones y un extra.
Para realizar la fosforilación de la polimerasa II CTD, retire el sobrenadante después de colocar la muestra en el bastidor magnético, y resuspender las perlas en 377 microlitros de BTB. Etiquetar dos tubos nuevos más H y menos H.To más H, añadir tres microlitros del factor de iniciación de transcripción TFIIH a la concentración de 300 nanogramos por microlitro, y menos H, añadir nueve microlitros de almacenamiento y tampón de dilución. Agregue 87 microlitros de los complejos de alargamiento lavados al tubo más H y 261 microlitros al tubo menos H.
Incubar los tubos durante 10 minutos y lavar con tampón de lavado. Para realizar el tapado de ARN, agregue 87 microlitros de mezcla de tapado al tubo más H y 261 microlitros al tubo menos H para resuspend. Etiquete cuatro tubos nuevos, cinco más H, cinco menos H, 15 menos H y 45 menos H, y dispense tres microlitros de cinco, 15 o 45 nanogramos por enzima de tapado de microlitro en los tubos correspondientes.
A continuación, prepare 12 tubos nuevos con 94 microlitros de tampón de parada. Inicie la primera reacción de taponamiento añadiendo 87 microlitros de complejo de alargamiento tratados con TFIIH al tubo etiquetado cinco más H.Incubar a 30 grados Celsius en un bloque de calor. Las reacciones de taponamiento deben cronometrando con precisión con un cronómetro.
Cuando se trabaja con múltiples reacciones, las horas de inicio de cada reacción deben ser escalonadas. Después de uno, dos o cuatro minutos, transfiera 30 microlitros de la mezcla de reacción más a tubos etiquetados con uno, dos y tres que contienen 94 microlitros de tampón de parada para detener las reacciones. Proceder con reacciones de taponamiento para las muestras en los tubos menos H restantes exactamente de la misma manera, utilizando complejos de alargamiento tratados sin TFIIH.
Analizar los productos de reacción en un gel de poliacrilamida desnaturalnativo. Aquí se muestra un diagrama para las moléculas de ADN y ARN en complejos de alargamiento artificial. Utilizando el oligo de ARN sintético de 20 nucleótidos como la imprimación de ARN durante el montaje de los complejos de alargamiento artificial, se añadieron nucleótidos durante cada paso secuencial del protocolo para generar un 23mer, un 25er y un 29mer.
Se compararon las reacciones con ARN polimerasa II de diferentes fuentes. Los complejos de alargamiento artificial se ensamblaron con polimerasa II endógena de tipo salvaje purificada del hígado de rata o de levadura de fisión y caminó para generar 23mermers o 25mermers. Se realizó un ensayo para medir el límite de las transcripciones radiomarcadas asociadas con complejos de alargamiento artificial que contenían 23 transcripciones de nucleótidos con un extremo de trifosfato de cinco primos.
Los dos últimos carriles muestran los productos de reacciones en las que se incubaron complejos de alargamiento con o sin enzima de tapado en presencia de TFIIH. Las bandas de migración más lenta y rápida contienen transcripciones tapadas y sin límite, respectivamente. Los primeros 12 carriles muestran el límite de las transcripciones asociadas con complejos de alargamiento con una CTD fosforilada o sin fosforilado.
Las actividades de la polimerasa II y otras enzimas pueden variar de la preparación a la preparación, por lo que es necesario optimizar las condiciones de reacción mediante la valoración de las concentraciones enzimáticas para definir niveles óptimos. Es importante utilizar material radiactivo de forma segura y evitar la contaminación. Por favor, asegúrese de seguir las pautas de su laboratorio e instituto al hacer experimentos con radiactividad.
