هنا ، أنشأنا نظامًا تجريبيًا بسيطًا يسمح بإعادة تشكيل مجمعات الاستطالة النشطة في Pol II المناسبة للتحقيق في الاقتران الوظيفي لنسخة Pol II ومواعيد الحمض النووي الريبي الريبي. مع هذا الأسلوب، يمكن تجميع مجمعات إطالة وظيفية بسهولة مع عدد قليل من المكونات. يتم شل مجمعات الاستطالة على الخرز المغناطيسي ، لذلك من السهل تغيير ظروف التفاعل.
لشل تثبيت oligo الحمض النووي التي تحتوي على البيوتين على الخرز المغناطيسي، أولا إضافة 200 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي إلى انخفاض البروتين ملزمة أنبوب 1.5 ملليلتر، ومن ثم وضع الأنبوب على رف المغناطيسي لمدة دقيقتين. بينما الأنبوب على الرف المغناطيسي، واستخدام ماصة لإزالة السائل من أنبوب دون إزعاج الخرز. لغسل الخرز، وإزالة أنبوب من الرف، وإضافة ملليلتر واحد من العازلة غسل تحتوي على تريس هيدروكلوريد، EDTA، وكلوريد الصوديوم.
أعيدي الأنبوب إلى الحامل. بعد دقيقتين، وإزالة محلول الغسيل، وتكرار يغسل مرتين أكثر باستخدام 200 ميكرولترات من نفس المخزن المؤقت. resuspend الخرز المغناطيسي في 400 ميكرولترات من 2X العازلة.
ثم، إضافة 380 ميكرولترات من المياه و 20 ميكرولترات من 10 ميكرومولار غير قالب الحمض النووي القلوي المخلاط لخلط. ضع الأنبوب على المجنة، ويحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بغسل الخرز بـ OLigo الحمض النووي غير المُشلّم ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثم ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من التخزين والتخزين المؤقت.
تخزين الأنبوب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لإنهاء حجب الخرز مع BSA. في اليوم التالي ، تخلص من الحل ، قم بإعادة بناء الخرز في 200 ميكرولترات من التخزين والتخزين العازلة ، للوصول إلى تركيز الحمض النووي التقريبي من خمسة ميكرومولار ، ومن ثم نقل الحل مع الخرز إلى أنبوب جديد. للحصول على الحمض النووي-RNA دوبلوج، إعداد مزيج 10 ميكرولتر الصلب في أنبوب PCR مع نسبة RNA-RNA-RNA-000 RNA-RNA- RNA- rna-lar، كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.
ضع الأنبوب في دورة حرارية. تعيين البرنامج إلى 45 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، تليها 12 دورة من دقيقتين لكل منهما، بدءا من 43 درجة مئوية وخفض درجة الحرارة بمقدار درجتين مئويتين في الدورة الواحدة. وأخيرا، يبقيه خاملا عند أربع درجات مئوية.
لتحميل RNA تنقية البوليميراز الثاني على الحمض النووي الريبي الهجين, مزيج ميكرولتر واحد من الحمض النووي DNA-RNA دوبليكس مع 13 ميكرولترات من البوليميراز الثاني الاحتياطية الطازجة في أنبوب. إضافة ميكرولتر واحد من البوليميراز RNA المنقى الثاني، ومزيج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا والتحريك مع طرف ماصة، دون إدخال فقاعات. احتضان الأنبوب لمدة 10 دقائق في 30 درجة مئوية.
لإكمال مجمع الممدنة ، إضافة ميكرولتر واحد من الخرز القلة الحمض النووي غير قالب غير مُشلّم إلى 14 ميكرولترات من مخزن الحمض النووي غير القالبي، وإضافة خليط 15 ميكرولتر إلى الأنبوب المحتضن سابقًا، واحتضانه لمدة 10 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية. ضع العينة على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقتين. غسل العينة مرة واحدة مع 30 ميكرولترات من العازلة غسل لإزالة البوليميراز غير مدمج الثاني و oligos.
إلى radiolabel مجمعات الاستطالة مع RNA 23mers، إضافة ميكرولتر واحد من ATP وميكرلتر واحد من UTP المشع إلى 23 ميكرولترات من العازلة نبض، وإضافة هذا الخليط إلى الخرز المغناطيسي غسلها إلى resuspend. احتضان رد فعل لمدة 10 دقائق للسماح لتركيب 23mers radiolabeled. إضافة 1.5 microliters من الحل الذي يحتوي على 100 مجهر ATP و 100 ميكرومولار UTP مزيج إلى 3.5 ميكرولترات من المخزن المؤقت مطاردة، وإضافة الخليط إلى أنبوب يحتوي على مجمعات الممستوءة مسبقا على الخرز.
مرة أخرى ، احتضان الأنبوب لمدة خمس دقائق لمطاردة جميع النصوص الوليدة في 23mers. ثم، ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي، واغسل كما كان يحدث سابقاً لإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة. Resuspend العينة في 30 ميكرولترات من العازلة الغسيل.
لتوليد مجمعات الممدود مع نصوص أطول، اتبع الإجراءات السابقة، وتوسيع نطاق أربعة أضعاف لتوليد 120 ميكرولترات من مجمعات المغاسل غسلها لأربعة ردود فعل. تسمية ثلاثة أنابيب جديدة 23mer، 25mer، و 29mer. نقل 30 ميكرولترات من مجمعات الإطالة غسلها إلى أنبوب 23mer، وإضافة 94 ميكرولترات من مزيج وقف تحتوي على البروتينات K والجليكوجين.
ضع الأنبوب الذي يحتوي على 90 ميكرولترات المتبقية من مجمعات الاستطالة المغسولة على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين ، وإزالة السوبر ، والخرز resuspend في 90 ميكرولتر من BTB تكمل مع 1.2 ميكرولترات من ATP وCTP. احتضان لمدة 10 دقائق في 30 درجة مئوية. بعد الغسيل مع 90 ميكرولترات من العازلة الغسيل، ونقل 30 ميكرولترات من مجمعات الاستحمام إلى أنبوب 25mer، وإضافة 94 ميكرولترات من مزيج وقف تحتوي على البروتينات K والجليكوجين.
مرة أخرى، ضع الأنبوب الذي يحتوي على 60 ميكرولترات المتبقية من مجمعات الاستطالة على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين. كرر العلاج BTB مع 60 ميكرولترات من العازلة تستكمل مع 0.8 ميكرولترات من ATP وCTP. بعد الحضانة والغسيل كما فعلت من قبل، resuspend العينة في 60 ميكرولترات من عازلة الغسيل.
نقل 30 ميكرولترers من العينة إلى أنبوب 29mer، وإضافة 94 ميكرولترات من وقف مزيج تحتوي على البروتينات K والجليكوجين. تحليل منتجات التفاعل على هلام البولي أكريلاميد denaturing. أولاً، توليد مجمعات استطالة مغسولة تحتوي على 23مرات عن طريق رفع 13 أضعاف الإجراء الموصوف سابقاً للحصول على 390 ميكرولترات لـ 12 رد فعل وأخرى إضافية.
لتنفيذ الفوسفور من البوليميراز الثاني CTD، وإزالة عظمى بعد وضع العينة في الرف المغناطيسي، وإعادة تعليق الخرز في 377 ميكرولترات من BTB. تسمية اثنين من أنابيب جديدة بالإضافة إلى H ونيقص H.To زائد H، إضافة ثلاثة ميكرولترات من عامل بدء النسخ TFIIH في تركيز 300 نانوغرام لكل ميكرولتر، وإلى ناقص H، إضافة تسعة ميكرولترات التخزين وتخفيف العازلة. إضافة 87 ميكرولترات من مجمعات الممدود غسلها إلى أنبوب زائد H و 261 ميكرولترات إلى أنبوب H ناقص.
احتضان الأنابيب لمدة 10 دقائق، وغسل مع عازلة الغسيل. لأداء غطاء الحمض النووي الريبي، إضافة 87 ميكرولترات من المزيج غطاء إلى أنبوب زائد H و 261 ميكرولترات إلى أنبوب H ناقص إلى resuspend. تسمية أربعة أنابيب جديدة، خمسة زائد H، خمسة ناقص H، 15 ناقص H، و 45 ناقص H، والاستغناء عن ثلاثة ميكرولترات من خمسة، 15، أو 45 نانوغرام لكل ميكرولتر تغطية الانزيم في الأنابيب المقابلة.
ثم، وإعداد 12 أنابيب جديدة مع 94 ميكرولترات من وقف العازلة. ابدأ أول رد فعل متوج بإضافة 87 ميكرولترات من مجمع التهطال المعالج بـ TFIIH إلى الأنبوب المسمى خمسة زائد H.Incubate عند 30 درجة مئوية في كتلة حرارية. ردود الفعل المتوجة تحتاج إلى أن تكون دقيقة التوقيت باستخدام ساعة توقيت.
عند العمل مع ردود فعل متعددة، يجب أن تكون متداخلة مرات البدء لكل رد فعل. بعد دقيقة واحدة أو اثنتين أو أربع دقائق، قم بنقل 30 ميكرولترات من خليط التفاعل الخمس بالإضافة إلى أنابيب تحمل اسم واحد واثنين وثلاثة تحتوي على 94 ميكرولترات من المخزن المؤقت لإيقاف التفاعلات. المضي قدما في تغطية ردود الفعل للعينات في أنابيب ناقص H المتبقية في نفس الطريقة تماما، وذلك باستخدام مجمعات استطالة تعامل دون TFIIH.
تحليل منتجات التفاعل على هلام البولي أكريلاميد denaturing. يظهر رسم بياني هنا لجزيئات الحمض النووي والحمض النووي الريبي في مجمعات الإستطالة الاصطناعية. باستخدام أولية الحمض النووي الريبي الاصطناعية من 20 النيوكليوتيدات كما التمهيدي RNA خلال تجميع مجمعات استطالة اصطناعية، تمت إضافة النيوكليوتيدات خلال كل خطوة المشي المتعاقبة للبروتوكول لتوليد 23mer، 25mer، و 29mer.
تم مقارنة ردود الفعل باستخدام البوليميراز RNA الثاني من مصادر مختلفة. تم تجميع مجمعات الاستطالة الاصطناعية مع بوليميراز من النوع البرية منقّح من إما كبد الفئران أو الخميرة الانشطارية وسار لتوليد 23مرات أو 25مرات. تم إجراء فحص لقياس وضع حد أقصى للنصوص المشعة المرتبطة بمجمعات استطالة اصطناعية تحتوي على 23 نسخة من النيوكليوتيدات مع نهاية ثلاثية الفوسفات الخماسية.
الممرات الماضيين تظهر منتجات ردود الفعل التي تم احتضان مجمعات الممدود مع أو بدون إنزيم في وجود TFIIH. تحتوي النطاقات المهاجرة الأكثر بطئًا وسرعة أكبر على نسخ مكتوبة ومُتغطى، على التوالي. تظهر الممرات الـ 12 الأولى وضع حد أقصى للنصوص المرتبطة بمجمعات التهطال مع CTD الفوسفورية أو غير الفوسفورية.
قد تختلف أنشطة البوليميراز الثاني والإنزيمات الأخرى من الإعدادية إلى الإعدادية ، لذلك من الضروري تحسين ظروف التفاعل عن طريق المعايرة تركيزات الإنزيم لتحديد المستويات المثلى. من المهم استخدام المواد المشعة بأمان وتجنب التلوث. يرجى التأكد من اتباع المبادئ التوجيهية المختبرية والمعهد عند إجراء التجارب مع النشاط الإشعاعي.
