La disección de señales de calcio a una resolución subcelular, es uno de los pasos más importantes para la decodificación de señales de calcio intracelulares que determinan el fenómeno biológico de salida. Este protocolo describe un nuevo método de diagnóstico por imágenes de calcio que permite el monitoreo del momento mismo de la afluencia de calcio y la liberación de calcio. Este protocolo es aplicable a todos los tipos celulares que permiten la expresión de indicadores de calcio codificados genéticamente.
Creemos que nuestro método tiene el potencial de ampliarse a la disección de señales de calcio a la resolución subcelular en animales vivos en el cultivo de laboratorio. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Matsumi Hirose, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, coloque el resbalón de la cubierta de vidrio de 18 milímetros de diámetro en cada pozo de una placa de 12 pozos.
Utilice agua esterilizada y prepare 12,5 mililitros de una solución de 0,4%PEI para cada placa de 12 pozos que se utilice. Agregue un mililitro de la solución PEI a cada pozo, y asegúrese de que no haya burbujas debajo de los resbalones de la cubierta. Incubar durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, utilice un aspirador para eliminar la solución PEI. Añadir un mililitro de agua esterilizada a cada pozo y agitar la placa para que la solución PEI entre el resbalón de la cubierta y la placa se lave a fondo. Repita este proceso de lavado dos veces más con agua fresca esterilizada.
Después del lavado final, aspirar el agua de cada pozo por completo. Dentro de la capucha, utilice una luz ultravioleta para secar y esterilizar los resbalones de la cubierta durante al menos 15 minutos. El plato recubierto de PEI se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos meses.
Cuando esté listo para proceder, ilumine los platos con la luz ultravioleta durante 15 minutos, justo antes de su uso. Añadir cinco mililitros de agua destilada estéril en el espacio entre los pozos para evitar la evaporación del medio de cultivo. Primero, lavar los cortices con la incubación salina.
Luego, incubar los cortices con Trypsin y DNAse en solución salina de incubación durante cinco minutos a 37 grados Centígrados. Luego, lave los cortices tres veces con la solución salina de incubación de hielo frío. Retire el sobrenadante y añada dos mililitros de medio de chapado complementados con 150 microlitros de DNAse I.
Disociar las células pipeteando veinte veces o menos y filtrar las células a través de un colador celular con un tamaño de poro de 70 micrómetros. A continuación, lave el colador celular con 20 mililitros del medio de chapado. Para la preparación de material celular congelado, lave las células con 20 mililitros del medio de lavado.
Diluir las células corticales con un medio de chapado a una densidad de 140 000 células viables por mililitro. A continuación, agregue un mililitro de la suspensión celular diluida a los resbalones de cubierta recubiertos de PEI en las placas de cultivo de 12 pozos. Mantener las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante dos o tres días.
Cuando las células estén estables, de dos a tres días después del enchapado, cambie el medio de cultivo al medio de mantenimiento. Para la preparación de la célula congelada, gire por la célula, utilizando un rotor oscilante para centrifugar las células a 187 veces G durante tres minutos. Aspirar el sobrenadante y añadir el medio de criopreservación, mantenido en cuatro grados Celsius, para obtener una densidad celular de 10 millones de células por mililitro.
Aliquot un mililitro de la suspensión celular en tubos criogénicos. Coloque los tubos en un recipiente de congelación celular con una velocidad de congelación de menos uno grados Celsius por minuto, hasta que se alcance una temperatura de menos 80 grados Centígrados. Transfiera el recipiente de congelación a un congelador a menos 80 grados Centígrados.
Para revivir las células congeladas, precaliente el medio de lavado y el medio de mantenimiento para las células corticales congeladas. A continuación, descongelar las células congeladas rápidamente en un baño de agua a 37 grados centígrados. Diluir las células suavemente con medio de lavado precalegado y centrífuga con un rotor oscilante a 187 veces G durante tres minutos.
Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de lavado y mida la densidad celular viable. Luego, diluir las células con el medio de mantenimiento para las células corticales congeladas, para producir una densidad celular de 300 000 células por mililitro. Cede un mililitro de esta suspensión celular en los pozos de las placas pei recubiertas de 12 pozos.
Para la transfección de tres a ocho días después del chapado, etiquete dos tubos, uno para el ADN plasmático y el otro para el reactivo de transfección. Añadir 50 microlitros de medio sérico reducido por pozo, a cada tubo. Añadir 0,5 microgramos de ADN plasmático por hoja de cobertura y un microlitro de suplemento acompañado de reactivo de transfección para las neuronas, por pozo al tubo de ADN plasmático.
Para la co-transfección de Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f, mezclar 0,5 microgramos de cada plásmido y un microlitro de suplemento en 50 microlitros de medio sérico reducido por pozo. A continuación, añada un microlitro de reactivo de transfección por pozo al tubo de reactivo de transfección. Vortex ambos tubos durante uno o dos segundos.
A continuación, añada la mezcla de reactivos de transfección a la mezcla de ADN. Pipetear suavemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Cargue esta mezcla en las células de una manera a gota.
Incubar en una incubadora de dióxido de carbono durante dos o tres días hasta que se expresen las proteínas marcadoras. Mezclar L y O para hacer la infección AAC. Añadir tres microlitros de AAC por pozo a la cultura mixta de neurona-astrocito.
Mece suavemente el plato para mezclar. Mantener el cultivo durante una o dos semanas hasta que se expresen los GECI. Primero monte el resbalón de cubierta que contiene las células transfectados con Lck-RCaMP2 y OER-CaMPG6f en la cámara de grabación del microscopio.
Agregue 400 microlitros del medio de imagen y coloque una tapa en la parte superior de la cámara. Elija el conjunto de filtros para GCaMP6f y la fuente de luz. Localice los astrocitos que expresan OER-GCaMP6f.
A continuación, elija un conjunto de filtros y una fuente de luz para RCaMP2 y confirme si Lck-RCaMP2 se expresa en los mismos astrocitos. Grabe imágenes de lapso de tiempo de Lck-RCaMP2 en dos Hertz durante dos minutos y guarde los datos de imagen. Después de esto, cambie el conjunto de filtros a ese para GCaMP6f.
Grabe imágenes de lapso de tiempo de OER-GCaMP6f a dos Hertz durante dos minutos y guarde los datos de imagen. En este estudio, Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f se expresan en células HeLa y ambas señales se registraron simultáneamente utilizando la óptica de división de imágenes, 24 horas después de la transfección. Tras la adición de histamina, la intensidad de la señal de Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f aumentó.
Los ciclos de tiempo de elevación de iones de calcio reportados por Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f se comparan en las mismas regiones de interés. Ambos sensores reportan una elevación de iones de calcio similar a una oscilación. Y ambos muestran el mismo curso de tiempo en dos de las cinco células examinadas.
Sin embargo, las elevaciones de iones de calcio mostradas por Lck-RCaMP2 permanecen en el nivel más alto que OER-GCaMP6f en las otras células. Estos resultados indican que la elevación del iones de calcio se prolonga en las proximidades de la membrana plasmática, mientras que se termina antes alrededor de la sala de emergencias, que es la fuente de esta señal de iones de calcio inducida por la estimulación de histamina. Las señales de iones de calcio espontáneos de astrocitos en el cultivo mixto de neurona-astrocitos de hipocampos y cortices de rata se muestran por Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f.
Las elevaciones espontáneas de iones de calcio son visibles sólo en el proceso astrocítico, no en el cuerpo celular, lo que es consistente con los informes anteriores. Las elevaciones espontáneas de iones de calcio por Lck-GCaMP6f en neuronas hipocampales de rata inmaduras se observan en dos Hertz. Los cursos de tiempo para cinco regiones de interés diferentes sugieren que estas elevaciones se limitan localmente a los dominios subcelulares.
Las neuronas de hipocampo de ratón maduros infectadas con vectores AAV de expresión OER-GCaMP6f muestran respuestas de iones de calcio en respuesta a la adición de DHPG. Para las imágenes de calcio, la potencia de luminación de excitación es el factor más crítico. Mantenga la luz de excitación lo más baja posible para evitar el foto-blanqueo y la foto-toxicidad.
Pomakorzi puede confirmar aún más la fuente de las señales de calcio utilizando inhibidores específicos de los canales de calcio. La decodificación de señales de calcio para evocar una salida específica ha sido una cuestión biológica fundamental. Esta técnica de imágenes de calcio allana el camino para describir la diversidad de señales de calcio intracelulares.
