膜靶向 ca 2 + 指标对培养细胞中局部 Ca^{2 +}信号的解剖

以亚细胞分辨率解剖钙信号是解码细胞内钙信号的重要步骤之一，用于解码决定输出生物现象的细胞内钙信号。该协议描述了一种新的钙成像方法，能够监测钙流入和钙释放的时刻。该协议适用于所有允许表达基因编码钙指标的细胞类型。

我们相信，我们的方法有潜力扩展到实验室培养中活体动物亚细胞分辨率下钙信号的解剖。帮助演示程序将是松美Hirose，一个技术人员从我们的实验室。要开始此过程，请将直径为 18 毫米的玻璃盖滑到 12 孔板的每个孔中。

使用消毒水，并准备 12.5 毫升 0.4%PEI 溶液，每 12 个孔板使用。在每个井中加入一毫升的PEI溶液，并确保盖滑下方没有气泡。在37摄氏度的二氧化碳孵化器中孵育过夜。

第二天，使用吸气器删除PEI解决方案。在每个井中加入一毫升灭菌水，并摇动板，使盖滑和板之间的PEI溶液被彻底洗净。使用新鲜消毒水重复此洗涤过程两次。

最后洗净后，从每一个井中完全吸水。在发动机罩内，使用紫外线干燥和消毒盖滑至少 15 分钟。PEI 涂层盘可以在四摄氏度下储存长达两个月。

准备好继续操作时，使用紫外线照亮盘子 15 分钟，就在使用前。在水井之间的空间中加入五毫升无菌蒸馏水，以防止培养介质蒸发。首先，用孵化盐水清洗皮质。

然后，在37摄氏度的孵育盐水中用三辛和DNAse孵育皮质5分钟。然后，用冰冷孵化盐水洗三次皮质。取出上一杯，加入两毫升电镀介质，辅以150微升的DNAse I库存。

通过移液二十次或更少分离细胞，并通过孔径为 70 微米的细胞过滤器过滤细胞。接下来，用20毫升的电镀介质清洗细胞过滤器。为了制备冷冻细胞储存，用20毫升的洗涤介质清洗细胞。

用电镀介质稀释皮质细胞，每毫升14万个活细胞的密度。然后，在 12 孔培养板中，将稀释的细胞悬浮液加入 PEI 涂层盖滑中。将细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中保持两到三天。

当细胞稳定时，电镀后两到三天，将培养介质更改为维护介质。为了制备冷冻细胞存量，使用回转子将细胞在187倍G下离心三分钟。吸升液并加入低温保存介质，保持在摄氏4度，获得每毫升1000万个细胞的细胞密度。

将一毫升的细胞悬浮液放入低温管中。将管子放入每分钟零下一摄氏度的冷冻容器中，直到达到零下80摄氏度的温度。将冷冻容器在零下 80 摄氏度时转移到冰柜中。

要恢复冷冻细胞，请预热冷冻皮质细胞的洗涤介质和维护介质。接下来，在37摄氏度的水浴中快速解冻冷冻细胞。使用预热洗涤介质轻轻稀释细胞，并在 187 倍 G 下用回转子离心，进行三分钟。

将颗粒重新悬浮在一毫升洗涤介质中，并测量可行的细胞密度。然后，用冷冻皮质细胞的维持介质稀释细胞，产生每毫升30万个细胞的细胞密度。将一毫升的这种悬浮液放入PEI涂层的12个孔板的井中。

对于电镀后三到八天的转染，标记两个管子，一个用于血浆DNA，另一个用于转染试剂。在每个管中加入50微升的减少血清介质。每个盖滑添加 0.5 微克血浆 DNA 和一微升补充剂，并伴有神经元转染试剂，每个井添加到血浆 DNA 管中。

对于Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f的共转染，将每个质粒的0.5微克和1微升的补充剂混合在每井50微升中减少血清介质。接下来，将一微升转染试剂添加到转染试剂管中。涡流两管一到两秒钟。

然后，将转染试剂混合物加入DNA混合物中。轻轻移液器在室温下混合和孵育五分钟。以滴的方式将混合物加载到细胞上。

在二氧化碳培养箱中孵育两到三天，直到标记蛋白被表达。混合 L 和 O 使 AAC 感染。每井添加三个亚光升的 AAC 到混合神经元-星细胞培养中。

轻轻摇动盘子混合。保持文化一到两个星期，直到GECIs被表达。首先将装有用 Lck-RCaMP2 和 OER-CaMPG6f 转染的细胞的盖板安装到显微镜的记录室中。

添加 400 微升成像介质，并在腔室顶部盖上盖子。选择 GCaMP6f 和光源的滤光片集。找到表达OER-GCAMP6f的星细胞。

接下来，选择 RCaMP2 的滤波器集和光源，并确认 Lck-RCaMP2 是否在同一天体细胞中表示。在两个赫兹录制 Lck-RCaMP2 的时间推移图像两分钟，并保存成像数据。在此之后，将筛选器设置更改为 GCaMP6f 的筛选器设置。

在两个赫兹下记录 OER-GCaMP6f 的时间推移图像两分钟，并保存成像数据。在这项研究中，Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f在 HeLa 细胞中表达，两个信号在转染后 24 小时同时使用图像分割光学技术进行记录。添加组胺后，Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的信号强度增加。

Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 报告的钙离子高程时间在相同的感兴趣区域进行比较。两个传感器都报告振荡状钙离子高程。两者都在检查的五个细胞中的两个显示相同的时间过程。

然而，Lck-RCaMP2显示的钙离子高程在其他细胞中仍高于OER-GCaMP6f。这些结果表明，钙离子升高在血浆膜附近被延长，而ER周围则提前终止，ER是组胺刺激引起的钙离子信号的来源。Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 显示了大鼠海马和皮质神经元星细胞中来自星细胞的自发钙离子信号。

自发的钙离子高程仅在天体过程可见，在细胞体中不可见，这与先前的报告一致。在未成熟的大鼠海马神经元中，Lck-GCaMP6f 的自发钙离子升高在两个赫兹被看到。五个不同感兴趣区域的时间课程表明，这些高程在本地仅限于子蜂窝域。

感染OER-GCaMP6f-表达式AAV的成熟小鼠海马神经元显示钙离子反应，以响应DHPG的添加。对于钙成像，激发光能是最关键的因素。请尽量保持激发光，以避免光漂白和照片毒性。

钙信号的来源可以通过Pomakorzi使用钙通道的特定抑制剂进一步确认。解码钙信号以唤起特定的输出一直是一个基本的生物学问题。这种钙成像技术为描述细胞内钙信号的多样性铺平了道路。