Este método soluciona un problema común en el campo y proporciona un flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido y la caracterización de vesículas extracelulares únicas con marcadores específicos de interés. El análisis de seguimiento de nanopartículas es un método semiautomático. Utiliza las propiedades de la dispersión de la luz y el movimiento Browniano para analizar la distribución del tamaño de las vesículas extracelulares.
Demostrando el procedimiento estará Vera Schmidt, una estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para aislar las vesículas extracelulares, después de recoger dos muestras de mililitros de sangre entera humana en tubos separadores de suero, permita que las muestras se coaglen durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de separar las células del suero por centrifugación. Transfiera un mililitro de suero de cada muestra a tubos de reacción individuales de 1,5 mililitros para la centrifugación para eliminar las plaquetas, y transfiera 100 microlitros del plasma pobre en plaquetas a nuevos tubos de reacción de 1,5 mililitros.
A continuación, añada 25 microlitros de solución de precipitación exosómica al plasma y el vórtice de las muestras a fondo. Después de una incubación de 30 minutos sobre hielo, recoger las vesículas extracelulares por centrifugación. El pellet aparecerá en color beige o blanco.
Aspirar el sobrenadante y centrifugar la muestra de nuevo. A continuación, retire todos los tramos de líquido y resuspenda el pellet en 100 microlitros de PBS. Para manchar las membranas celulares de las vesículas, agregue 10 microlitros de la suspensión EV a 50 microlitros de solución de tinte etanómico PKH67 recién preparada y mezcle bien.
Después de cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, diluir 50 microlitros de la suspensión de vesícula extracelular teñida con 2,5 mililitros de agua destilada en un tubo cónico de 15 mililitros, con una mezcla completa. Para etiquetar las vesículas con anticuerpos, diluir de 10 a 20 microlitros de la suspensión extracelular de vesículas sin mancha con 50 microlitros de agua destilada en un tubo de reacción de 1,5 mililitros, con una mezcla exhaustiva. Añadir de 2,5 a cinco microlitros del anticuerpo de interés al tubo de reacción, con una mezcla exhaustiva, para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
A continuación, transfiera 50 microlitros de las vesículas etiquetadas a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga el volumen experimental adecuado de agua destilada, con una mezcla exhaustiva, como se indica en la tabla. Antes de analizar las vesículas extracelulares manchadas o etiquetadas, primero mueva el filtro de fluorescencia a la trayectoria óptica del microscopio y la cámara, e inicie el programa, siguiendo las instrucciones en la pantalla para la implementación automatizada. En la pestaña Comprobación de celda, seleccione el número de celda correcto para la medición de fluorescencia y la posición de referencia para la óptica, para confirmar que el láser y el microscopio están en un enfoque común.
Utilice una jeringa para vaciar el canal celular con 10 mililitros de agua destilada, teniendo cuidado de que la célula de medición esté libre de burbujas de aire y de que las burbujas de aire no se inyecten en el sistema. A continuación, diluir 10 microlitros de partículas de poliestireno con fluorescencia de 200 nanómetros en 990 microlitros de agua destilada y añadir 10 microlitros de esta suspensión de partículas en un tubo de 15 mililitros que contiene 10 mililitros de agua destilada. A continuación, inyecte 2,5 mililitros de la primera solución de partículas diluidas en el canal de celda y haga clic en Optimizar enfoque para ajustar la cámara.
Para medir la muestra, enjuague el canal celular varias veces con 10 mililitros de agua destilada e inyecte la suspensión de vesícula extracelular teñida. Con la posición de referencia, ajuste los parámetros de adquisición adecuados en la ficha Comprobación de celda, como se indica en la tabla. Para identificar el rango de sensibilidad óptimo, haga clic en Número de partículas frente a.
Sensibilidad, para mostrar una curva de las partículas medidas por pantalla para los diferentes niveles de sensibilidad. Para el parámetro Obturador, ajuste el período de tiempo que la cámara permite que la luz pase durante un intervalo determinado. Para los parámetros de postaquisición, seleccione un brillo mínimo de 20, un tamaño mínimo de 20 nanómetros y un tamaño de medición máximo de 500 nanómetros.
Observe el número de partículas detectadas en el campo de visión de la pantalla. La barra de dispersión debe estar en el rango de verde a naranja, de 50 a 300 partículas. Haga clic en Comprobar deriva de partículas en Cero voltios y abra la pestaña Medición.
Haga clic en Ejecutar adquisición de vídeo y establezca el Número de experimentos en tres a cinco y el retardo de tiempo entre experimentos en cero minutos. Establezca el número de posiciones individuales del subvolumen en 11 y el número de ciclos de medición en 10 en cada posición de medición en la que se van a analizar las partículas. A continuación, seleccione una carpeta, cree un nuevo nombre de archivo y haga clic en Aceptar para iniciar la medición.
Al final del análisis, abra la pestaña Análisis para revisar los resultados. A continuación, compruebe el número medio de partículas por posición, el número total de partículas trazadas y la concentración de partículas, el ancho de distribución de las partículas y el valor de la media, y la desviación estándar. El uso de perlas fluorescentes para el ajuste y calibración de la medición proporciona una sensibilidad de ajuste óptima del 85%Utilizando estos ajustes, la cámara muestra una imagen nítida y las mediciones repetidas demuestran una baja desviación estándar.
La tinción con un kit de vinculador celular que incluye un vinculador celular fluorescente que incorpora un tinte fluorescente verde con colas largas y alifáticas en regiones lipídicas de la membrana celular, revela una fuerte correlación entre la sensibilidad y el número de partículas medidas. El anticuerpo de tinción de vesícula extracelular contra una proteína de interés indica una distribución de partículas de 220 a 1, 145 nanómetros, con un tamaño máximo máximo de 541 nanómetros. No se detectan vesículas extracelulares después de la tinción de anticuerpos de agua libre de vesículas de control, hasta una sensibilidad cercana al 100% Si la medición se inicia cuando la deriva es superior a 5 micrómetros por segundo, las repeticiones individuales muestran desviaciones distintas.
Es importante tener en cuenta que el uso de isotiocianato de fluoresceína como fluorocromo da lugar a mediciones inexactas e irreproducibles, ya que este fluoróforo es propenso a la fotoblancada rápida. Este protocolo aborda la demanda principal de muchos investigadores en este campo para una caracterización rápida de vesículas extracelulares únicas, utilizando marcadores específicos. A pesar del hecho de que, en la última década, los métodos han mejorado considerablemente, todavía no existe un protocolo estandarizado para el análisis de vesículas extracelulares únicas.
Independientemente del progreso futuro de la investigación sobre la biología de vesículas extracelulares, este método proporciona un protocolo rápido y fiable para la caracterización de vesículas extracelulares únicas utilizando marcadores específicos. Debido a que nuestros protocolos actuales no implican largos tiempos de procesamiento o pasos intensivos en mano de obra, también son adecuados para un alto rendimiento de la muestra.
