Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la respuesta de miRNA a la capacidad de estrés en injertos de plantas, como cómo se regulan los miRNA bajo estrés frío en injertos de calabaza de botella de sandía. La principal ventaja de esta técnica es que es un método altamente eficiente y reproducible para hacer homo y heteroinjertos. No requiere ningún equipo específico, es muy fácil de realizar, y por lo general resulta en una tasa de supervivencia muy alta de injerto.
A través de este método, puede proporcionar información sobre la respuesta de miRNA al estrés frío en el sistema de injerto de calabaza de botella de sandía. También se puede aplicar a otros organismos modernos para revelar los mecanismos del transporte miRNA local y de larga distancia. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de injerto son difíciles de aprender.
Este paso requería habilidades avanzadas y son clave para la supervivencia de las plantas injertadas. Para empezar, remoja las semillas de calabaza de la botella en un vaso de precipitados de 500 mililitros de 58 grados centígrados de agua. Revuelva las semillas ocasionalmente hasta que la temperatura del agua baje a 40 grados centígrados.
Mientras el agua se enfría, coloca tres kilogramos de tierra de turba en una bolsa de nylon y autoclave. Una vez que el agua alcance la temperatura ambiente, enjuague las semillas de dos a tres veces en agua destilada y drene el exceso de agua. Deje que las semillas broten en una bolsa de gasa a 28 grados centígrados en la cámara de crecimiento oscuro.
Después de la germinación, sembrar las semillas en macetas de plástico llenas con el suelo de turba esterilizada. Cuando las plántulas de calabaza de la botella desarrollen dos cotiledones aplanados, repita este proceso con semillas de sandía. Cultivar la calabaza de la botella y las plántulas de sandía en una cámara de crecimiento.
Agregue agua a las plántulas una vez al día por la tarde. A continuación, cortar los hipocotilos de las plántulas de sandía de dos a tres centímetros por debajo de los cotiledones. Cortar la parte superior de la botella de plántulas de calabaza en el lado, inmediatamente por encima de los cotiledones.
A continuación, utilice un palillo de dientes para hacer un agujero en la parte superior de la botella recortada plántulas de calabaza. Inserte las plántulas de sandía recortadas en el orificio para hacer heteroinjertos. Después de esto, preparar homoinjertos utilizando el método descrito anteriormente.
En primer lugar, envuelva las plántulas injertadas en bolsas de polietileno transparente para mantener una humedad relativamente alta. A continuación, mantenga las plántulas envueltas en una cámara de crecimiento durante siete días. Después del séptimo día, retire las bolsas y deje que las plantas crezcan en las mismas condiciones durante siete a 10 días.
Divida las plántulas en dos grupos, uno para tratamientos fríos y otro para el control. Devuelva las plántulas de control a las mismas condiciones ambientales. Coloque las plántulas tratadas en frío en una cámara de crecimiento establecida en seis grados celsius con las mismas condiciones oscuras claras que el grupo de control.
Después de 48 horas, deje las muestras de los scion y portainjertos de los injertos. Congele las muestras inmediatamente en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 70 grados centígrados. Transfiera la muestra congelada a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros en nitrógeno líquido.
Agregue un cordón de acero inoxidable a cada tubo de muestra y homogeneice los tejidos a un polvo fino. Para cada combinación de injerto, tome cantidades iguales de muestra molida de 10 plántulas y mezcle en un tubo centrífugo de 10 mililitros. Añadir una cantidad adecuada de reactivo de clorhidrato de guanidio.
A continuación, agregue DNase sin ARN de una a 150 unidades por mililitro a 37 grados Centígrados durante una hora. A continuación, determine la cantidad total de ARN en un sistema de electroforesis microcapilar. Después de esto, descongele los reactivos y adaptadores de normalización de la biblioteca.
A continuación, ligar pequeño RNase con los cinco adaptadores primo y tres primos, y eluir y purificarlos. Transcribir de forma inversa los cinco primos y tres RNase pequeños ligados de primera calidad siguiendo las directrices del fabricante. A continuación, realice la amplificación de PCR siguiendo el protocolo del fabricante.
A continuación, utilice el sistema de electroforesis microcailar para asegurarse de que el número de integridad del ARN es mayor que siete. Cargue un microlitro de una biblioteca de ARN en el sistema de electroforesis microcapilar para asegurarse de que el número de integridad del ARN sea mayor que siete. Por último, secuencia las pequeñas bibliotecas de ARN en un instrumento de secuenciación de alto rendimiento.
Usando este protocolo, se obtuvo una tasa de supervivencia del 98% para el injerto y los fenotipos para condiciones de temperatura ambiente y estrés frío. sRNAs de 24 nucleótidos conformó la mayor clase de sRNAs en todas las combinaciones de injerto, independientemente del tratamiento de temperatura. Después de 48 horas de tratamiento en frío, 30 y 268 microARN fueron regulados hacia arriba y hacia abajo, respectivamente.
En las hojas del scion en heteroinjertos, por el contrario, en las hojas del portainjerto, 31 y 12 microRNas fueron reguladas hacia arriba y hacia abajo, respectivamente. En los homoinjertos de sandía-sandía, 64 y 83 microARN fueron regulados hacia arriba y hacia abajo, respectivamente. Esto demostró que el heterografo causó una profunda reprogramación de las expresiones de microARN.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar el tamaño relativo y la edad del tallo de la hija y el scion es fundamental para hacer un injerto exitoso. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de lncRNA, el perfilado proteómico para investigar la regulación del lncRNA y la proteína y el sistema de codificación en el sistema de injerto. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de la tolerancia abiótica de la planta para explorar el mecanismo de ventaja de injerto de plantas en Cucurbitaceae y más allá.
No olvide que trabajar con clorhidrato de guanidina puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas con la realización de este procedimiento.
