Name: Video: Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 8.4K vistas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 + vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando

We are grateful to Dr. Jos&#233; Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscop&#236;a Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#236;a (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiolog&#236;a, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Tem&#225;tica Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

La sangre periférica de donantes varones sanos se obtuvo con el consentimiento informado y la aprobación del Comité de Bioética del Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos. 1. Aislamiento y activación de T humanas indiferenciadas CD4 + células <ol><li> Recoger 2 ml de sangre periférica derivadas de donantes humanos sanos mediante el consentimiento informado y se diluye con 2 ml de PBS estéril-EDTA (1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), EDTA 2 mM, pH 7,4). Añadir la sangre diluida lentamente en la parte superior de 3 ml de solución de sacarosa con 1,077 de densidad como se describe anteriormente 8. Nota: La migración diferencial durante la centrifugación causado por diferencias en la densidad hará que los eritrocitos sedimentan a completamente y una capa de células mononucleares menos densos formará anteriormente. 2 ml de sangre periférica se rinden aproximadamente 0,5 x 10 6 células T CD4 + vírgenes después de la Purificatisobre las medidas. </li><li> Centrifugar 30 minutos a 250 xg en 21 ° C (uso rotor para tubos de fondo redondo con ángulo fijo de 30 mm) sin interrupción para generar el gradiente de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Después de la centrifugación, el PBMC se puede observar claramente como un anillo blanco. Recoger las PBMCs con una pipeta y transferir al tubo estéril para el lavado. </li><li> Después de tres lavados con solución de PBS-EDTA a 250 xg durante 10 min proceder a la purificación de células T CD4 + vírgenes. métodos de selección o varios tipos de kits de purificación están disponibles para este propósito. Preferiblemente, utilice&gt; 1 x 10 7 PBMCs para la purificación. <ol><li> Purificar las células T CD4 + no tratados previamente por selección negativa con perlas magnéticas. Realizar la selección negativa con anticuerpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, y CD235a (glicoforina A). Evaluar el porcentaje de pureza mediante la determinación de células CD45RA + CD4 + a través de fcitometría de baja. Nota: Opcionalmente, se procede a la incubación de las PBMC durante la noche a 37 ° C y 5% de CO 2 con una densidad de 1 x 10 6 células / ml en 10 ml de medio suplementado para promover la adhesión de los monocitos y continuar con la purificación ingenuo células T CD4 +. La recuperación eficiente de las células T CD4 + vírgenes de sangre periférica depende en gran medida del sistema de purificación. </li></ol></li><li> Preparar placas de cultivo celular de 24 pocillos mediante la adición de 250 l por pocillo de PBS con anticuerpo 5 mg / ml de anti CD3 monoclonal y se incuba durante al menos 2 horas a 37 ° C. Nota: Las placas con 96 pocillos se pueden utilizar cuando se utiliza un número más pequeño de células T CD4 + no tratados previamente (por ejemplo, 2 x 10 4 -1 x 10 5). </li><li> Retire la dilución de anticuerpo anti CD3 desde el 24 de pozo o placas de 96 pocillos y se lavan las placas dos veces con PBS estéril 1x. </li><li> Diluir las células T CD4 + no tratados previamente con&gt; 95% de pureza (CD4 +CD45RA +) a una densidad de 1 x 10 6 células / ml en avanzado 1640 medio RPMI suplementado con 3% de suero bovino fetal (o RPMI suplementado con 10% de suero), glutamina 2 mM y antibióticos (1 U / ml de penicilina, 1 g / ml de estreptomicina). Nota: Si se requiere la localización de gangliósidos en PBMCs, siguen el mismo protocolo para la dilución y estimulación como se describe a continuación. </li><li> Añadir 500 l de la dilución de células a pocillos recubiertos anti-CD3 y a los pozos no recubiertos (células de control) en la placa de 24 pocillos. Alternativamente, añadir 100 l de la dilución de células a los pocillos de la placa de 96 pocillos. </li><li> Completar las condiciones de estimulación de células T CD4 + vírgenes en los pozos de anti-CD3 recubiertos mediante la adición de 1 mg / ml de anticuerpo anti CD28. </li><li> Mantener las células T CD4 + en reposo como el control en los pocillos no revestidos sin la adición de anticuerpos anti CD28. Incubar el reposo y activadas de células T CD4 + durante 0 a 72 horas en condiciones estándar de 37 °C y 5% de CO 2. </li><li> Para verificar una activación adecuada evaluar mediante citometría de flujo la expresión del marcador de activación temprana CD69 (16 horas después de la activación) o CD25 marcador de activación tardía (48 horas después de la activación) en reposo y activadas las células T CD4 + vírgenes se incubaron a 37 ° C y 5% de CO 2 en ausencia o presencia de anticuerpos anti CD3 / CD28 9,10. </li></ol> 2. La adhesión de reposo y activadas las células T naive CD4 + <ol><li> Esterilizar 12 mm cubreobjetos redondos en autoclave y exposición a la luz UV durante al menos 15 minutos. </li><li> Coloque los cubreobjetos en placas de cultivo celular de 24 pocillos estériles. Nota: Para los cultivos con células de menos de 1 x 10 5, es preferible utilizar cámaras de diapositivas con pozos pequeños adaptados para evitar la dispersión de células en cubreobjetos. </li><li> cubreobjetos de la capa (o cámara de diapositivas) con 200 l de poli-L-lisina (MW 150 a 300 KDa) 0,1% (w / v) de la solución y se incuba durante 5 min a rtemperatura oom (RT), eliminar y secar durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar con cuidado y recoger el reposo y las células T CD4 + activadas ingenuas de las placas de 24 pocillos. Contar las células y, si es necesario, ajustar con medio suplementado fresco para transferir 1 x 10 5 células a los cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina. Se incuban las células durante un mínimo de 6 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> 3. La recolección y fijación de reposo y activadas Naïve células T CD4 + <ol><li> Retirar con cuidado el medio de reposo y se cultivaron las células T CD4 + activadas ingenuos. </li><li> Añadir 500 l de PBS estéril RT lentamente. Nota: Además cuidadosa y la eliminación de soluciones de los pozos impide el desprendimiento de células del cubreobjetos. </li><li> Desechar el PBS y añadir otros 500 l de PBS para eliminar completamente los medios de cultivo. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 500 l filtrada paraformaldehído al 4% (filtración elimina micropartículas que pueden interferir con el análisis de microscopía) y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente (preferido) o durante la noche a 4 ° C. Precaución: El paraformaldehido es un compuesto tóxico y volátil. Se sabe que es un carcinógeno humano. Utilice con cuidado con un protocolo de seguridad adecuado. </li><li> Retire el fijador y lavar al menos dos veces con PBS a temperatura ambiente. </li><li> Proceder al siguiente paso o mantener los pozos de la placa con 500 l de PBS a 4 ° C durante varios días hasta que las manchas. Nota: La esterilidad durante este proceso ayuda a evitar el crecimiento de microorganismos. </li></ol> 4. La tinción, montaje y visualización mediante microscopía confocal <ol><li> Retire el PBS de los pozos. Añadir 500 l de tampón de bloqueo frío (1x PBS, 0,5% de grado estándar de albúmina de suero bovino, 1% de suero fetal bovino pH 7,4). Incubar durante 20 minutos en hielo. </li><li> Retire el amortiguador de bloqueo y añadir con cuidado los anticuerpos primarios (anti gangliósidos GD3 R24 clon, clon GD2 14G2a),PE-conjugado anti CD25 y APC-conjugado anti TCR e isotipos controles diluidos en tampón de bloqueo a 2,5 g / ml. </li><li> Incubar 2 horas en el hielo o la noche a 4 ° C. Nota: agitación orbital lenta es preferible. </li><li> Retire el anticuerpo con cuidado y lentamente añadir 500 l de PBS. Repetir dos veces. </li><li> Añadir los anticuerpos secundarios (FITC conjugado anti IgG3 para R24 contra GD3, Alexa Fluor 488-conjugado o Alexa Fluor 647-conjugado anti IgG2a para 14G2a contra GD2) diluido en tampón de bloqueo a 0,1 g / ml. </li><li> Incubar durante 1 hora en hielo en la oscuridad sin agitación. </li><li> Lavar tres veces en PBS como se describe en 4.4). Mantener los pocillos con PBS suficiente para evitar la deshidratación de las muestras. </li><li> Añadir Hoechst 333258 mancha diluido en PBS a 0,1 g / ml. </li><li> Incubar 15 minutos a temperatura ambiente y quitar. Lavar tres veces en PBS. </li><li> Colocar los portaobjetos en una toalla de papel y añadir 20 l de solución de montaje (50% de glicerol en PBS) o solución de montaje comercials para evitar la decoloración y el enfriamiento rápido de las muestras. </li><li> Recoja cuidadosamente el cubreobjetos con unas pinzas finas y colocarlo en la solución de montaje. Asegúrese de que el lado del cubreobjetos donde se unen las células está en contacto con la solución. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas y analizar mediante fluorescencia o microscopía confocal. </li></ol> 5. Aislamiento de ARN <ol><li> Preparar anticuerpo anti CD3 (5 mg / ml) recubiertas placas de 96 pocillos. Incubar 4 x 10 4 células T CD4 + vírgenes / pocillo en 100 l de medio de cultivo suplementado con el anticuerpo CD28 contra (1 mg / ml) para completar el estímulo. Incubar a 37 ° C y 5% de CO2 durante 0-72 hr. </li><li> Después de diferentes tiempos post-activación colocar las células en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 500 l de PBS y centrifugar a 250 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de reactivo Trizol. </li><li> Incubar durante 5 min a temperatura ambiente y mantener la muestra a -8076; C durante al menos 24 h. Proceder con el aislamiento de ARN cuando sea necesario. Nota: Dejar la muestra a -80 ° C durante al menos 24 horas mejora el rendimiento de ARN. Además, el uso de guantes de la mano es esencial para evitar la degradación del ARN por RNasas. </li><li> Descongelar la muestra de incubación a 37 ° C durante 2 min en un baño de agua. </li><li> Añadir 200 l de cloroformo y agitar con fuerza a mano durante 30 segundos (para evitar la mezcla agresiva de ARN mediante agitación). Incubar 5 min a TA. </li><li> Centrifugar 15 minutos a 12.000 xga 4 ° C. </li><li> Recuperar la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 500 l de isopropanol y se invierte el tubo tres veces. </li><li> Incubar 10 min a RT y se centrifuga durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante por inversión. </li><li> Añadir 1 ml de hielo frío de etanol 75% y se centrifuga 10 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Completamente descartar el sobrenadante y secar el pellet de ARN dejando el tapón del tubo abierto. Noe: En este punto el pellet no es claramente visible. Procede de todas maneras. </li><li> Resuspender el precipitado en 20 l de agua de grado molecular. Calcular la concentración y pureza de los ácidos nucleicos mediante la medición de la absorbancia 260 nm y 280 nm usando NanoDrop. </li><li> Proceder con cuidado para la síntesis de ADNc mediante el uso de cualquier kit de transcriptasa inversa convencional y siguiendo el protocolo del fabricante. Nota: Aproximadamente 0,5 a 2 g de ARN se obtiene a partir de 4 x 10 4 células T CD4 + vírgenes. cDNA puede ser sintetizado a partir de 100 ng de ARN y se utiliza en tiempo real, las reacciones de PCR sin la necesidad de kits de entrada baja de ARN. </li></ol>

<ol>
	<li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+tango+to+quadrilla:+current+views+of+the+immunological+synapse.">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li><li>Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+human+CD4++T-cell+population:+two+distinct+CD4++T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms.">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li><li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSOM+/+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+/+CD3+Mediated+T-Cell+Activation.">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498 (2013).</li><li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNAS+Plus:+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation.">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li><li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acids+in+the+brain:+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development,+stability,+disease,+and+regeneration.">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li><li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Mu&#241;oz, M. E., L&#242;pez-Guerrero, D. V., Mart&#236;nez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+human+na&#239;ve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters.">Activation of human na&#239;ve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li><li>M&#252;thing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids.">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li><li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation.">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li><li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A.">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li><li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation,+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection.">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li><li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients.">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li><li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand.">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li><li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis.">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li><li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex.">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li><li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming:+implications+for+quality+control.">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li><li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+(GD3+synthase)+gene+in+human+cancer+cell+lines:+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes.">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li><li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+(CD60b)+and+7-O-acetyl-GD3+(CD60c)+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes.">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li><li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD3,+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody.">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El protocolo descrito se puede utilizar para localizar gangliósidos o proteínas en las suspensiones de células de células T CD4 + o otras células inmunes (por ejemplo, PMBCs, figura 5) a partir de un pequeño número de células. Debido al pequeño tamaño de las células T y las propiedades no adherentes, la adquisición de fluorescencia imágenes microscópicas se obtenga información mala o baja calidad si las células están no se cumplen correctamente. <p class="jove_co...

Las células T CD4 + orquestan la respuesta inmune a través de sus funciones efectoras después de la activación por las células presentadoras de antígeno 1. El estudio de los mecanismos celulares que están moduladas durante la activación permite penetración en un proceso básico de la función inmune. Sin embargo, el estudio de las células T CD4 + vírgenes puede ser complicado debido a que representan una población muy pequeña de células en la periferia de sangre 2. A través de microscopía de fluorescencia varios informes han estudiado la localización de diferentes moléculas implicadas en la activación de células T CD4 +, principalmente proteínas asociadas a la membrana plasmática 3. Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico y aunque han sido ampliamente estudiados en las células nerviosas en el que son abundantes, otras células tales como las células inmunes también expresan gangliósidos con biológicamente funciones relevantes 4,5. Hemos informado anteriormente de that durante la activación de las células T CD4 + vírgenes humanos hay una regulación por incremento de la α2,8 sialiltransferasa ST8Sia 1 (GD3 sintasa) y la sintasa GM2 / GD2, que inducen la neoexpression superficie significativa de GD2 y la regulación al alza de GD3 gangliósido 6. El estudio adicional de GD3, GD2 y otros gangliósidos en células inmunes, es necesario complementar una vista parcial a base de proteínas de la función inmune. Comúnmente, el estudio de la expresión de gangliósidos se basa en técnicas tales como cromatografía en capa fina (TLC) 7, pero esta técnica no permite la localización espacial de los gangliósidos en la membrana plasmática o en compartimentos subcelulares, limitando el análisis biológico. En este trabajo, se describe un protocolo para la identificación mediada por anticuerpos y localización de GD3 y GD2 gangliósidos en células T CD4 + vírgenes humanos y PBMCs después de la activación anti-CD28 anti-CD3 /. Con este protocolo se iTambién es posible analizar el gen y la expresión molecular de gangliósidos en un bajo número de células en suspensión, con la adquisición de imágenes de alta calidad 6, teniendo en cuenta el pequeño tamaño de los linfocitos (9 m).

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Suplemented with 3% FBS</td></tr><tr><td>mouse anti human CD3 antibody</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human CD28 antibody</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD3&amp;nbsp; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 clone</td></tr><tr><td>mouse anti human GD2 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a clone</td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse IgG3&lt;br/&gt; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek chamber slide system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI and IX81&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GD3 synthase</td><td>5&amp;acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td><td>5&amp;acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&amp;acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr></tbody></table>

preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy

Los métodos aquí descritos para la activación de las células T CD4 + no tratados previamente en suspensión y su adhesión en cubreobjetos para el análisis de microscopía confocal permiten la localización espacial y la visualización de los gangliósidos que participan en la activación de células T CD4 +, que la expresión complemento experimentos de perfiles tales como citometría de flujo, en el oeste Blot o PCR en tiempo real. La cuantificación de la expresión de gangliósidos a través de citometría de flujo y su localización celular a través de microscopía se puede obtener por el uso de anticuerpos anti-gangliósido con alta afinidad y especificidad. Sin embargo, un manejo adecuado de células en suspensión implica el tratamiento de placas de cultivo para promover la adherencia necesaria requerida para la fluorescencia o la adquisición microscopía confocal. En este trabajo, se describe un protocolo para determinar GD3 y GD2 expresión de gangliósidos y colocalización con el TCR durante la activación de ingenuo células T CD4 +. También, en tiempo real, texperimentos ime PCR usando &lt;40.000 células se describen para la determinación de la GD3 y GM2 genes / GD2 sintasa, lo que demuestra que los experimentos de análisis de gen se puede realizar con un bajo número de células y sin la necesidad de kits adicionales bajos de ARN de entrada.

El protocolo descrito en este manuscrito hace que una buena calidad de culto y de descanso adherido y las células T CD4 + vírgenes humanos activados (Figura 1). Las células T CD4 + activadas muestran el perfil proliferativa característica (Figura 1B) en comparación con la condición de reposo (Figura 1A). El marcador de activación CD25 tarde es útil para evaluar la activación eficiente en 72 hr observada por...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy at JoVE.com

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 + vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando &lt;40.000 células que no requieren kits adicionales bajos de ARN de entrada.

Preparación de CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

8.4K vistas.  Universidad Autónoma del Estado de Morelos.  Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 + vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando 

Video: Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Investigación

Biología

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Inmunología e Infección

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

Extracción, purificación y perfilado de gangliósidos

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Bioquímica

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Neurociencias

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

Aislamiento concomitante de astrocitos primarios y microglia para la infección por parásitos protozoos

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

Source: Fouda, A., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55199">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> J. Vis. Exp., (2017).
This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds&#39; stimulatory and inhibitory effects, respectively.

Ensayo basado en fluorescencia que utiliza linfocitos modificados genéticamente para el cribado de compuestos inmunomoduladores

1. Preparation of Splenocyte Medium and Flow-cytometry Buffer

	Perform all steps under a 70% ethanol-cleaned biological hood.
	Remove 70 mL of pre-warmed ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An In Vitro Technique to Differentiate GM-CSF Producing T Helper Cells from Na&iuml;ve T Cells

Source: Lu, Y., et al.&#160;<a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58087">In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the in vitro differentiation of granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor or GM-CSF-producing T helper cells (THGM). Isolated na&#239;ve T cells are stimulated for differentiation into THGM, which is confirmed by detecting high intracellular GM-CSF production and a low expression of other T helper cell-specific cytokines.

Una técnica in vitro para diferenciar las células T auxiliares productoras de GM-CSF de las células T vírgenes

Source: Lu, Y., et al.&#160;In Vitro&#160;Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) ...

Preparación de CD4

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video