Los estudios que proporcionaron los animales fueron financiados por el Departamento de Alimentación, Medio Ambiente y Asuntos Rurales del Reino Unido y la Unión Europea (a través de la financiación del Laboratorio de Referencia de la ETE de la UE). Agradecemos el apoyo de los gerentes del proyecto, el Dr.M. Simmons y el Dr.M. Jeffrey.

1. Evaluación de la postura
<ol><li>Evaluar la postura del animal mientras no está perturbado.</li>
	<li>Los animales afectados por las EET pueden estar de pie con extremidades anchas, pueden parecer encorvados o pueden estar de pie con un carro de cabeza baja.</li>
</ol>2. Evaluación del comportamiento
<ol><li>Estudiar el comportamiento del animal, cuando se deja solo, cuando se acerca y cuando se maneja.</li>
	<li>Los animales afectados por las ETE pueden mostrar una alteración por estar separados de otras ovejas o no seguir inmediatamente a otras ovejas.</li>
	<li>Cuando el animal se acerca, puede huir y colapsar, o se derrumba al suelo cuando se manipula. El circular compulsivo en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj se puede observar en ovejas con tembladera atípica.</li>
</ol>3. Pruebas de respuesta a la amenaza
<ol><li>Sostenga la cabeza del animal para probar la respuesta de amenaza: mueva la mano o varios dedos varias veces hacia cada ojo del animal para inducir una respuesta de parpadeo, pero tenga cuidado de no tocar ningún vello facial o crear cualquier turbulencia del aire que pueda hacer que el animal parpadee.</li>
	<li>La respuesta de amenaza puede estar ausente en los animales afectados por la tembladera, en particular en las ovejas con tembladera atípica. Aunque la prueba de la respuesta de la amenaza sea la única prueba del nervio craneal usada como parte del protocolo, la inspección visual de la cara durante este procedimiento puede revelar otras muestras de déficits neurológicos no considerados normalmente en tembladera, e.g. parálisis facial. Si el animal no parpadea en respuesta a la amenaza es recomendable probar el reflejo palpebral tocando los párpados para asegurarse de que la incapacidad del animal para parpadear no es causada por parálisis facial.</li>
</ol>4. Prueba de la respuesta de scratch
<ol><li>Asegúrese de que el animal esté tranquilo durante este procedimiento porque la prueba no se puede interpretar en un animal que lucha.</li>
	<li>Áreas de rasguño de la espalda en las regiones torácica, lumbar y sacra, haciendo una pausa entre cada episodio de rascado.</li>
	<li>Si el animal responde con movimientos rítmicos de la cabeza o del cuerpo, o se mueve o lame sus labios al rascarse un área en particular, repita la prueba de rasguño para confirmar la reproducibilidad de la respuesta al rasguño.</li>
	<li>Una respuesta repetible se provoca generalmente en los animales que son pruríticos, que incluye generalmente ovejas con la tembladera clásica o cabras con la forma prurítica de tembladera, pero no hay generalmente ninguna respuesta en ovejas con tembladera anormal a menos que otras condiciones pruríticas de la piel o ectoparásitos estén presentes.</li>
</ol>5. Comprobación de pérdida de lana y lesiones cutáneas
<ol><li>Inspeccione la piel.</li>
	<li>El prurito debido a la tembladera generalmente causa pérdida de cabello, que puede estar en la encuesta, espalda, grupa, lado del pecho o abdomen debido al roce excesivo o rasguño donde la piel subyacente parece normal.</li>
	<li>Las abrasiones pueden aparecer más tarde si el animal tiene la oportunidad de frotar objetos punzantes. Las heridas de la mordedura pueden aparecer, particularmente en los miembros, debido al mordisqueo excesivo de los miembros.</li>
</ol>6. Puntuación condición corporal
<ol><li>Evaluar la condición corporal del animal palpando los procesos dorsales y transversales de las vértebras lumbares.</li>
	<li>La tembladera puede causar una pérdida progresiva de la condición corporal donde los procesos transversales de las vértebras lumbares se pueden sentir fácilmente individualmente, y los extremos de los procesos aparecen agudos.</li>
</ol>7. Vendar los ojos al animal
<ol><li>Cubra los ojos del animal con una capucha, que se puede hacer usando cualquier bolsa no vista donde se corte una esquina para permitir la respiración del animal.</li>
	<li>Libere al animal solo si no hay problemas de seguridad y no hay riesgo de lesiones debido a un animal en pánico; de lo contrario, mantenga a las ovejas y estudie los movimientos de los animales mientras sigue teniendo el control del animal.</li>
	<li>Vendarse los ojos puede exacerbar los signos de un sistema vestibular o disfunción cerebelosa, que puede ser oscurecida por la capacidad del animal para compensar a través de su visión. La pérdida de equilibrio, de incoordinación, o de dar vueltas se puede sacar, particularmente en ovejas de otra manera clínico unremarkable con tembladera anormal.</li>
</ol>8. Evaluación del movimiento del animal
<ol><li>Estudia la marcha y los movimientos musculares del animal cuando se mueve libremente.</li>
	<li>La incoordinación puede caracterizarse por movimientos de base ancha de las extremidades posteriores, saltando con ambas extremidades traseras, o balanceándose excesivamente en los cuartos traseros, lo que puede resultar en tropezar o sentarse brevemente.</li>
	<li>La presencia de un temblor de cabeza es a menudo sutil cuando el animal no está perturbado, pero puede llegar a ser más notable durante o después de la finalización del examen clínico.</li>
</ol>9. Interpretación
<ol><li>Considere la importancia de los hallazgos con respecto a la tembladera.</li>
	<li>Aunque la presencia de signos individuales, como una respuesta repetible al rascado, temblor, comportamiento anormal, círculos, colapso de episodios, ataxia o una respuesta de amenaza ausente, puede tener varias causas, la aparición combinada de dos o más de estos signos es altamente sugestiva de tembladera en ovejas o cabras.</li>
</ol>

<ol>
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Todos los procedimientos relacionados con animales se llevaron a cabo de conformidad con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales de 1986, bajo licencia del Ministerio del Interior del Gobierno del Reino Unido. Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La tembladera es una enfermedad incluida en la lista de la Organización Mundial de la Salud animal (OIE), que, en ausencia de una prueba ante mortem rápida y fiable, depende de la capacidad de los agricultores o veterinarios para reconocer los signos clínicos asociados con esta enfermedad. Sin embargo, la mayoría de los casos de tembladera, en particular los casos atípicos de tembladera, se encuentran actualmente mediante la vigilancia específica de las ETE, es decir, mediante el examen cerebral de pequeños rumiantes sujetos a sacrificio o animales muertos. La cría de ovejas para la resistencia a la tembladera clásica, que redujo el número de casos clásicos de tembladera, muy probablemente también redujo la conciencia de las personas para la enfermedad, de modo que se considera con menos frecuencia en el diagnóstico diferencial de trastornos neurológicos en ovejas. La tembladera atípica también tiene una baja prevalencia, con aproximadamente cinco casos en mataderos y ocho casos en ganado muerto por cada 10.000 examinados en Europa4. Además, el prurito, generalmente evidente como alopecia con o sin excoición, a menudo se considera un signo característico de la tembladera13. Así, una enfermedad neurológica sin prurito concomitante según lo observado en la tembladera anormal12 o la forma nonpruritic de tembladera caprina11 puede no levantar la suspicacia de la tembladera.
Este protocolo de examen se diseñó para identificar signos clínicos de ET en ovejas mediante la evaluación de signos clínicos específicos asociados con diversos tipos de tembladera (tembladera atípica y clásica, esta última representada por una oveja inoculada con EEB atípica, que presentaba signos clásicos similares a la tembladera). En la tembladera clásica, el porcentaje de casos que mostraron una respuesta positiva al rasguño ("reflejo mordisqueo") varió de 50-77 en más de 100 ovejas estudiadas5,8. Los trastornos del movimiento pueden observarse en hasta el 81% de los casos clásicos de tembladera basados en diversos estudios18. La incoordinación es también un signo importante en varios casos naturales de tembladera atípica, a menudo acompañados de cambios de comportamiento1,pero los signos adicionales reportados tanto en ovejas con tembladera atípica infectadas natural como experimentalmente fueron alrededores y discapacidad visual12,15,16,por lo que se incluye en el protocolo de examen el vendado de los ojos y la prueba de la respuesta a la amenaza. La puntuación de la condición corporal, por ejemplo utilizando un sistema de puntuación de 6 puntos14, permite la evaluación de la emaciación, que puede observarse en ovejas afectadas por la tembladera5. Aunque anteriormente se han propuesto criterios clínicos para ayudar en la detección de la tembladera en el ganado ovino2,estos sólo se referían a la detección de la tembladera clásica y tenían en cuenta la historia clínica, que puede no estar disponible si los animales se presentan en un matadero.
El protocolo actual permite el cribado de muchos animales en busca de signos de tembladera en un corto período de tiempo. Además, el protocolo de examen se puede aplicar a estudios experimentales de tembladera en ovejas y cabras para controlar el inicio clínico, la progresión y el punto final. Sin embargo, no sustituye un examen físico y neurológico más detallado por un registro adecuado de los antecedentes clínicos, posiblemente seguido de pruebas diagnósticas auxiliares (examen de sangre y líquido cefalorraquídeo; técnicas de imagen más sofisticadas si procede), que pueden ser necesarias posteriormente para descartar otras afecciones en pequeños rumiantes que presenten signos similares. , como enfermedades neurológicas metabólicas o inflamatorias, abscesos cerebrales o tumores.
Aunque un examen clínico es generalmente menos sensible a la detección de animales afectados por las ETE que las pruebas post mortem basadas en la detección de la proteína priónica2,11,especialmente en una fase temprana del período de incubación, este es actualmente el único método de detección en animales vivos y más pertinente para aquellos países que no cuentan con un sistema de vigilancia específico para identificar a los pequeños rumiantes afectados por las ETE.

La tembladera es una encefalopatía espongiforme transmisible (ETE) de ovejas y cabras, que pertenece al grupo de trastornos por plegamiento incorrecto de proteínas, como la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en el ganado vacuno, la enfermedad de derroche crónico en los ciervos y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en los seres humanos. El diagnóstico se realiza post mortem mediante la detección de la forma anormal de la proteína priónica, que es resistente a las proteinasas, generalmente en el cerebro. Se pueden distinguir dos formas principales de tembladera natural, que son epidemiológica, patológica y bioquímicamente diferentes: la tembladera clásica y la tembladera atípica. Además, una enfermedad neurológica con signos clínicos clásicos similares a la tembladera puede ser inducida en ovejas y cabras por infección experimental con el agente de la EEB6,10-11. De hecho, la EEB natural se ha diagnosticado en cabras3,17. El control de la tembladera clásica (y de la EEB en el ganado ovino si se produjo de forma natural) se ha logrado mediante la cría para la resistencia genética dirigida al gen de la proteína priónica, pero esto es más difícil para la tembladera atípica, que se cree que es una enfermedad esporádica y se ha diagnosticado en países considerados libres de tembladera clásica, por ejemplo, Nueva Zelanda7.
La tembladera es una enfermedad neurológica de ovejas y cabras adultas dando por resultado cambios en comportamiento, sensación, y movimiento, pero la enfermedad es lentamente progresiva, y las muestras clínicas no se reconocen a menudo porque el encargado animal o el cirujano veterinario pueden no ser familiares con las muestras clínicas, o la tembladera no se considera en absoluto en la diagnosis diferenciada de enfermedades neurológicas en pequeños rumiantes.
El protocolo de examen propuesto se diseñó para ayudar en el diagnóstico clínico de la tembladera con dos propósitos en mente: debe ser considerablemente breve para permitir la exploración de muchos animales en un corto período de tiempo, pero lo suficientemente específico como para permitir la detección de animales afectados por la tembladera, lo que se logra mediante la evaluación de la presencia de signos clínicos que se encuentran con frecuencia en los animales afectados por la tembladera. Este protocolo es una ligera modificación del utilizado para vigilar a las cabras en busca de signos de tembladera clásica11 e incluye vendar los ojos al animal, lo que puede exacerbar los signos clínicos no asociados normalmente con la tembladera9.

clinical examination protocol to detect atypical and classical scrapie in sheep

El diagnóstico de la tembladera, una encefalopatía espongiforme transmisible (ETE) de ovejas y cabras, se basa actualmente en la detección de proteínas priónicas asociadas a la enfermedad mediante pruebas post mortem. A menos que se monitorice activamente una muestra aleatoria de la población de ovejas o cabras para detectar la tembladera, la identificación de los casos de tembladera se basa en la notificación de sospechosos clínicos, que depende de la familiarización del individuo con la enfermedad y de la capacidad de reconocer los signos clínicos asociados con la tembladera. La tembladera puede no ser considerada en el diagnóstico diferencial de enfermedades neurológicas en pequeños rumiantes, particularmente en países con baja prevalencia de tembladera, o no reconocida si se presenta como forma no veruriginosa como la tembladera atípica. Para ayudar en la identificación de sospechosos clínicos, un protocolo corto de la examinación se presenta para evaluar la exhibición de muestras clínicas específicas asociadas a las formas pruríticas y no priuriticas de TSE en ovejas, que se podrían también aplicar a las cabras. Esto incluye la evaluación del comportamiento, la visión (mediante la prueba de la respuesta a la amenaza), el prurito (al probar la respuesta al rascado) y el movimiento (con y sin vendar los ojos). Esto puede conducir a un examen neurológico más detallado de la notificación de animales como sospechosos de tembladera. También podría utilizarse en estudios experimentales de ETE de ovejas o cabras para evaluar la progresión de la enfermedad o para identificar el punto final clínico.

Ovejas clínicamente sanas. Poll Dorset wether from a scrapie-free flock intracerebrally inoculated with bovine brain of New Zealand origin and examined at 49 months post inoculation. Esta oveja tiene una postura normal, se comporta normalmente, muestra una respuesta de amenaza normal (Figura 1), no reacciona a la prueba de rasguño, tiene un vellón intacto, y una muy buena condición corporal. Es clínicamente poco notable cuando se le vendan los ojos y no muestra signos de un trastorno del movimiento.
Ovejas con tembladera atípicas que presentan la forma no veruritaria de ETE en ovejas. Cheviot wether de una manada tembladera-libre intracerebrally inoculado con homogeneato del cerebro de un caso anormal del campo de la tembladera del mismo genotipo de la proteína del prión (AHQ/AHQ) y examinado en la inoculación del poste 36 meses. Esta oveja también tiene una postura normal, pero se comporta de manera diferente a las otras ovejas en la pluma y los círculos en el sentido de las agujas del reloj. No parpadea cuando se prueba la respuesta de amenaza. Rascarse no provoca ninguna respuesta, y no hay cambios en lana son evidentes, pero la condición del cuerpo es justo. Gira en el sentido de las agujas del reloj cuando tiene los ojos vendados(Figura 2)y pierde el equilibrio. La marcha es atáxica, y un temblor fino de la cabeza es visible.
Ovejas atípicas de la EEB que presentan con la forma prurítica de ETE en ovejas, que es clínico similar a la presentación clínica de ovejas tembladera-afectadas clásicas. Por esta razón, no se incluye un caso clásico de tembladera. Encuesta Dorset wether de un rebaño libre de tembladera intracerebrally inoculado con bovino atípico (tipo L) homogeneización cerebral DE LA EEB y examinado a los 50 meses después de la inoculación. Esta oveja se encuentra ligeramente encorvada, tiende a mantener las extremidades traseras de base ancha y cae al suelo cuando es atrapada. La respuesta de amenaza es débil. El rascado de varias áreas de la espalda provoca movimientos de la cabeza o los labios(Figura 3),y hay pérdida de lana con un traumatismo cutáneo menor en la encuesta. La condición corporal es buena. Cuando tiene los ojos vendados, es reacio a moverse y apoya su parte trasera en el obstáculo para mantener el equilibrio. La oveja es atáxica y muestra hipermetria del miembro anterior.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig1.jpg"> Figura 1. Pruebas de respuesta a la amenaza. El gesto amenazante hacia el ojo del animal induce una respuesta de parpadeo. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig2.jpg"> Figura 2. Vendar los ojos. En el sentido de las agujas del reloj, se provocaba vendando los ojos a las ovejas con una capucha. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51101/51101fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51101/51101fig3.jpg"> Figura 3. Prueba de la respuesta de rasguño. Rascarse la espalda provoca lamerse los labios con movimientos laterales de la cabeza <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51101/51101fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

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Clinical Examination Protocol to Detect Atypical and Classical Scrapie in Sheep

Un protocolo clínico corto de la examinación se presenta para ayudar en la detección de tembladera clásica y anormal en ovejas y cabras.

Protocolo de examen clínico para detectar la tembladera atípica y clásica en ovejas

The diagnosis of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy (TSEs) of sheep and goats, is currently based on the detection of disease-associated ...

clinical-examination-protocol-to-detect-atypical-classical-scrapie

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

12.9K vistas.  Animal Health and Veterinary Laboratories Agency Weybridge. Un protocolo clínico corto de la examinación se presenta para ayudar en la detección de tembladera clásica y anormal en ovejas y cabras.

Video: Clinical Examination Protocol to Detect Atypical and Classical Scrapie in Sheep

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Monitoreo células inmunes Tráfico Varillas fluorescente priones horas de la infección intraperitoneal

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Investigación

Inmunología e Infección

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Análisis de Conversión de proteínas

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Medicina

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, there is a need to validate additional diagnostic techniques to improve rabies surveillance, particularly in developing countries. Here, we present a standard protocol for the DRIT as an alternative, laboratory or field-based testing option that uses light microscopy as compared to the DFA. Touch impressions of brain tissue collected from suspect animals are fixed in 10% buffered formalin. The DRIT uses rabies virus-specific monoclonal or polyclonal antibodies (conjugated to biotin), a streptavidin-peroxidase enzyme, and a chromogen reporter (such as acetyl 3-amino-9-ethylcarbazole) to detect viral inclusions within infected tissue. In approximately 1 h, a brain tissue sample can be tested and interpreted by the DRIT. Evaluation of suspect animal brains tested from a variety of species in North America, Asia, Africa, and Europe have illustrated high sensitivity and specificity by the DRIT approaching 100% with results compared to DFA. Since 2005, the United States Department of Agriculture&#8217;s Wildlife Services (USDA WS) program has conducted large-scale enhanced rabies surveillance efforts using the DRIT to test &#62;94,000 samples collected from wildlife in strategic rabies management areas. The DRIT provides a powerful, economical tool for rabies diagnosis that can be used by laboratorians and field biologists to improve current rabies surveillance, prevention and control programs globally.

The direct rapid immunohistochemical test (DRIT) offers a World Organization for Animal Health and World Health Organization (OIE/WHO) recognized alternative to the direct fluorescent antibody (DFA) test for rabies diagnosis. This test allows for field-based applications that can be performed in approximately 1 h upon brain impressions using light microscopy.

Vigilancia mejorada de la rabia mediante una prueba inmunohistoquímica rápida directa

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the entire state, with the exception of New York City. The Rabies laboratory necropsies a variety of animals ranging in size from bats to bovids. Most of these specimens are animals exhibiting neurological signs, however, less than 10% actually test positive for rabies; implying trauma, lesions or other infectious agents as the cause of these symptoms. Due to the risk of aerosolizing undiagnosed infectious agents, the Rabies Laboratory does not use power tools or saws. Three necropsy techniques will be presented for animals whose skulls are impenetrable with scissors. The laboratory has implemented these techniques to decrease potential exposure to infectious agents, eliminate unnecessary manipulation of the specimen and reduce processing time. The advantages of a preferred technique opposed to another is subject to the trained individual processing the specimen.

The goal of this protocol is to demonstrate safe necropsy techniques in small and large animals to obtain satisfactory tissue samples for rabies testing.

Técnicas de Necropsia de Rabia en Animales Grandes y Pequeños

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the ...

Neurociencias

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

Prueba de deslizamiento de laboratorio de seguridad priónica

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

Detección de proteína priónica anormal por inmunohistoquímica

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Inducción y evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones

Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic autoimmune inflammatory disease affecting the central nervous system (CNS). It is characterized by different prevalence in the sexes, affecting more women than men, and different outcomes, showing more aggressive forms in men than in women. Furthermore, MS is highly heterogeneous in terms of clinical aspects, radiological, and pathological features. Thus, it is necessary to take advantage of experimental animal models that allow the investigation of as many aspects of the pathology as possible. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) represents one of the most used models of MS in mice, modeling different disease features, from the activation of the immune system to CNS damage. Here we describe a protocol for the induction of EAE in both male and female C57BL/6J mice using myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) immunization, which leads to the development of a chronic form of the disease. We also report the evaluation of the daily clinical score and motor performance of these mice for 28 days post immunization (28 dpi). Lastly, we illustrate some basic histological analysis at the CNS level, focusing on the spinal cord as the primary site of disease-induced damage.

Autor destacado: Creación de un modelo experimental versátil de encefalomielitis autoinmune relevante para ratones machos y hembras 

Experimental autoimmune encephalomyelitis is one of the most widely used murine models of multiple sclerosis. In the current protocol, C57BL/6J mice of both sexes are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide, resulting mainly in ascending paresis of the tail and limbs. Here we discuss the protocol of EAE induction and evaluation.

Protocolo de examen clínico para detectar la tembladera atípica y clásica en ovejas

Resumen

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Capítulos en este video

Monitoreo células inmunes Tráfico Varillas fluorescente priones horas de la infección intraperitoneal

Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Vigilancia mejorada de la rabia mediante una prueba inmunohistoquímica rápida directa

Técnicas de Necropsia de Rabia en Animales Grandes y Pequeños

Prueba de deslizamiento de laboratorio de seguridad priónica

Detección de proteína priónica anormal por inmunohistoquímica

Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG_35-55

Protocolo de examen clínico para detectar la tembladera atípica y clásica en ovejas

Resumen

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Monitoreo células inmunes Tráfico Varillas fluorescente priones horas de la infección intraperitoneal

Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un

En tiempo real temblando inducida por conversión de ensayo para la detección de priones CWD en materia Fecal

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Vigilancia mejorada de la rabia mediante una prueba inmunohistoquímica rápida directa

Técnicas de Necropsia de Rabia en Animales Grandes y Pequeños

Prueba de deslizamiento de laboratorio de seguridad priónica

Detección de proteína priónica anormal por inmunohistoquímica

Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG35-55

Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG_35-55