Damos las gracias a Jonna Ellis por su asistencia editorial. El proyecto descrito fue apoyada por el premio número R01MH079751 (IP: F. Peruzzi) del Instituto Nacional de Salud Mental. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud Mental o los Institutos Nacionales de Salud.

1. Poly-D-lisina (PDL): Preparación <ol><li> Añadir 5 ml de ddH estéril 2 O a 5 mg de PDL para obtener una solución madre de 1 mg / ml. </li><li> Mezcle la solución stock de pipetear varias veces. </li><li> Usar inmediatamente o almacenar poli-D-lisina solución a 2-8 ° C. </li></ol> 2. Poly-D-lisina (PDL): revestimiento de plástico placas de cultivo de células <ol><li> Diluir la solución madre de PDL con estéril O ddH 2 a la concentración final de 10 g / ml. </li><li> Pipeta suficiente solución en un plato de 60 mm para cubrir el área cultivo de superficie (3 ml para un plato mm 60). </li><li> Roca suavemente para asegurar un recubrimiento de la superficie de cultivo. </li><li> Incubar las placas revestidas a temperatura ambiente (TA) durante la noche. </li><li> Al día siguiente, por lo general el día de la disección, se retira la solución de poli-D-lisina por aspiración y se lava brevemente con 3 ml de ddH estéril O. 2 Repita este paso. Tras el segundo lavado, eliminar el agua completamente por aspiración. </li><li>Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante hasta tres semanas. </li></ol> 3. Poly-D-lisina (PDL) y laminina: Preparación y revestimiento de vidrio de dos cámaras de diapositivas <ol><li> Mezcla PDL (1 mg / ml) y laminina (1 mg / ml) en soluciones madre estéril O ddH 2 a la concentración final de 10 y 5 ug / ml, respectivamente. </li><li> Pipeta suficiente solución en los pocillos de un vidrio de dos cámaras de diapositivas para cubrir el área de superficie de cultivo (1 ml para cada pocillo de un vidrio 2 también de dos cámaras de diapositivas). </li><li> Roca suavemente para asegurar un recubrimiento de la superficie de cultivo. </li><li> Incubar las placas revestidas a TA durante la noche. </li><li> Al día siguiente, retire la solución de revestimiento de poli-D-lisina-laminina mediante aspiración y lavar suavemente dos veces con 1 ml de agua estéril ddH 2 O. Tras el segundo lavado, eliminar el agua completamente por aspiración. </li><li> Cámara de diapositivas se puede almacenar a 4 ° C durante hasta tres semanas. </li></ol> Nota: Cualquier diapositiva cámara de vidrio se pueden recubrir following este protocolo. A menudo utilizamos las diapositivas de dos cámaras, ya que cada diapositiva proporciona la configuración del control de la prueba experimental (por ejemplo, no se trata en comparación con tratamiento, en comparación con untransfected transfectadas). 4. Disección neuronal y Cultura <ol><li> Calentar los siguientes reactivos en un baño de agua 37 ° C: <ul type="disc"><li> TrypLE Express en su original botella de 100 ml. </li><li> Neurobasal/B27 medio completo (véase I cuadro). El volumen calentado depende del número de platos para ser chapado (por ejemplo 30 ml de diez placas de 60 mm chapados). </li></ul></li><li> Añadir 3 ml de solución fría de hibernación E para cuatro placas de 60 mm y 13 ml de cultivo a un tubo de 15 ml BD Falcon polipropileno de alta claridad cónica. </li><li> Añadir 25-30 ml de medio de disección en frío (véase el cuadro II, el Dr. Olimpia Meucci, comunicación personal) para cada uno de los tres platos de 100 mm cultura. Estas placas, que contienen un gran volumen de medio, se utiliza para lavar los embriones inmediatamente después de sula eliminación de las bolsas amnióticas (medidas 4.7 y 4.8). </li><li> La eutanasia de una rata E17 cronometrado embarazada de CO 2 de acuerdo con la Política de Servicios de Salud Pública de Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio y bajo un cuidado de los animales y el uso institucionalmente aprobó el protocolo. </li><li> Rociar con el abdomen inferior 70% de EtOH y corte medial a través de la piel y los músculos con un par de tijeras que exponen el útero y los embriones. </li><li> Retire todos los fetos y colóquelos en un recipiente estéril de 100 mm plato que contiene un exceso de medio de disección en frío (25-30 ml, véase el paso 4.3). </li><li> Cortar los embriones con un pequeño par de tijeras de saco amniótico y colocarlos en el segundo plato de 100 mm que contenían medio de disección fría. </li><li> Lavar los embriones a temperatura ambiente inclinando suavemente el plato 100-mm durante 5-10 segundos. Luego, transferir los embriones lavados al plato mm tercera 100 que contiene el medio de disección. Dos lavados en medio de un exceso suelen ser suficientes para eliminar todos los rastros de sangre. Sin embargo, si ncopcuando fuere necesario, lavar una vez más con una nueva de 100 mm, plato que contiene 25-30 ml de medio de disección en frío. </li><li> Utilizando una pinza estereomicroscopio y curvos, extraer el cerebro de cada embrión de rata tirando de la piel y el cráneo. Coloque todo el cerebro en uno de los platos de 60 mm (por lo general, con no más de 5 cerebros por plato) con Hibernate fría E. Mantener estas placas de hielo. </li><li> Tome un plato a la vez y, en virtud de un microscopio de disección, separar los hemisferios y aislar a la eliminación de las cortezas cerebrales del cerebro medio y las meninges. </li><li> Opcional: los cerebros de corte a lo largo de la línea media, extraer los hipocampos, y siga el siguiente procedimiento para aislar las neuronas del hipocampo. </li><li> Recoge todas las cortezas disecados en una de 15 ml tubo transparente cónica que contiene 13 ml de frío Hibernate E. Dejar las cortezas cerebrales en el hielo hasta que todas las disecciones se han completado. Debido a su pequeño tamaño, diseccionaron hipocampos se pueden recoger en un tubo Eppendorf de 1,5 ml en lugar de un tubo de 15 ml. Si se desea, en este paso o cortezashipocampos se puede colocar en un vial que contiene criotubo 1 ml de Hibernar E + 2% B27 + gentamicina (50 mg / ml) + Fungizone (250 ng / ml) en la proporción de 2-4 cortezas o 2-4 hipocampos por vial. El tejido cerebral se puede almacenar a 4 ° C en la oscuridad durante hasta una semana (más tarde los tiempos no han sido probados todavía). Cuando sea necesario, utilice unas pinzas finas para transferir el tejido cerebral a un tubo de 15 ml que contiene Hibernate E y luego seguir el protocolo de abajo para aislar a las neuronas. </li><li> Transferir el tubo a una campana de cultivo de tejidos. Permitir las cortezas se depositen en el fondo del tubo y luego retirar con cuidado el sobrenadante. </li><li> Añadir 13 ml de fresca E Hibernar al tubo cónico de 15 ml, permiten cortezas se depositan en el fondo del tubo y retire cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso 2 veces más y, después del último lavado, retire con cuidado todos los medios de comunicación. </li><li> Enzimáticamente digerir cortezas cerebrales mediante la adición de 1-2 ml (dependiendo del número de cortezas; utilizar menos para el aislamiento del hipocampo) de Tr cálidosypLE Express. Sellar la tapa del tubo con Parafilm y flotar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos. </li><li> Rocíe el tubo con etanol al 70% antes de abrir la tapa y añadir 10 ml de Hibernate E. Permita que las cortezas para ubicarse en la parte inferior del tubo y eliminar el sobrenadante. Repita este paso tres veces para vaciar TrypLE Express. En el último paso, retirar con cuidado todos los medios de comunicación. </li><li> Suavemente triturar (4-5 veces) las cortezas en 2 ml de medio completo Neurobasal/B27 utilizando un pulido al fuego Pasteur de vidrio (aproximadamente 1 mm de diámetro). Tenga cuidado para evitar las burbujas. </li><li> Repetir otro 4-5 veces con una estéril Pasteur de vidrio más pequeña pipeta de diámetro (es decir, una pipeta de 1.2 a 3.4 mm de diámetro). No utilice una pipeta Pasteur o menor que este va a destruir las células. </li><li> Permita que las piezas restantes de tejido (por lo general muy pocos, si los hubiera) para resolver. </li><li> Transferir la parte superior de una sola célula suspensión a un nuevo tubo de 15 ml, dejando tras de piezas colocadas de tejido. Pielther diluir la suspensión de células hasta 10-12 ml con Neurobasal/B27 medio completo. </li><li> Mezclar bien y diluir las células para contar mediante la adición de 10 l de suspensión de células a 490 l de solución de conteo 50x (ver tabla III) en un tubo de 1,5 ml de Eppendorf. </li><li> Células de placas sobre placas recubiertas PDL en la densidad de 5,0 x 10 4 / cm 2. Si nucleofection se va a realizar, se recomienda placas las células a una concentración superior (8-10 x 10 4 / cm 2). </li><li> Normalmente, diseccionar 9-10 fetos por experimento, ya que aproximadamente 13 x 10 6 neuronas se derivan de cada feto E17. Si el número de embriones son necesarios, asegúrese de que todo el procedimiento no durará más de dos horas. </li><li> Si se desea, 24 horas después del aislamiento, 10 M de citosina-β-D-arabinofuranosido (AraC) se puede añadir a cada plato, con el fin de prevenir la proliferación glial. Sin embargo, este paso no es necesario ya que Neurobasal/B27 medio inhibe la proliferación glial, Según las recomendaciones del fabricante (Invitrogen / Gibco). </li><li> Las neuronas pueden ser utilizados para los experimentos después de 4-5 días in vitro, aunque el tiempo exacto depende de la etapa diferenciación deseada. Tenemos neuronas cultivadas para hasta 4 semanas sin una disminución significativa en la supervivencia (Figura 1). </li><li> Para el cultivo prolongado, sustituya medio de cultivo cada semana con recién preparada Neurobasal/B27 medio completo. </li></ol> 5. Los resultados representativos Las neuronas cultivadas en cámara de diapositivas de cristal puede ser sometido a inmunocitoquímica. Figura 1 muestra una imagen típica de una neurona cortical fijado después de cinco días de cultivo y immunolabeled con anti-MAP-2 anticuerpo para mostrar los procesos neuronales. La figura 2 muestra una imagen representativa de una neurona del hipocampo de rata después de 3 semanas en cultivo. La morfología neuronal de una célula completamente diferenciada se destaca por el MAP-2 immunolabeling (MAP-2 marcador neuronal, el clon de anticuerpo monoclonal de ratón AP-20, Gene Tex, Irvine, CA), siguiendo un procedimiento estándar que se describió anteriormente 1. Las imágenes se visualizan con la Nikon Eclipse E400 microscopio vertical de fluorescencia equipado con cámara de agua EXI (Qimaging), motor del eje Z, y SlideBook5 adquisición / deconvolución software (Imagen Inteligente Innovations, Inc., Denver, CO). Una serie de imágenes tridimensionales de cada imagen individual se deconvoluted a una imagen bidimensional y se resolvieron mediante el ajuste de la señal de corte a la intensidad máxima cerca de aumentar la resolución. La Figura 3 muestra la pureza de los cultivos neuronales. Proteína lisados ​​se obtuvieron a partir DIV7 cultivos neuronales de rata (CTX) y de un caso de glioblastoma humano (MBG). Como era de esperar, el lisado neuronal es muy positivo para la proteína neuronal MAP-2 y negativa para el marcador de astrocitos GFAP, mientras que el lisado de proteínas GBM es negativa fo MAP-2 y positivas para GFAP. Aunque en el protocolo que hemos estado usando Hibernate E durante varios años como medio de disección y aclarado, recientemente, hemos explorado un uso adicional y muy práctica de la misma para preservar los tejidos del cerebro para su uso posterior. La Figura 4 muestra un par de días in vitro 5 (DIV5) la cultura de las neuronas corticales de rata aisladas de cortezas mantenerse a 4 ° C durante una semana en Hibernate E + B27 después de la disección original de los embriones. Las neuronas se cultivaron sobre un vidrio de dos cámaras de diapositivas recubierta con PDL y laminina como se describió previamente. La imagen adquirida se deconvoluted utilizando SlideBook5 adquisición / software de deconvolución como se ha descrito anteriormente (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig1.jpg" /> Figura 1. Imagen representativa de una neurona cortical nucleofected con pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) y immunolabeled con MAPA-2 De anticuerpos, de color rojo. Magnificación original 100x. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig2.jpg" /> Figura 2. Imagen representativa muestra MAP-2 inmunomarcación, en rojo, de las neuronas del hipocampo después de 3 semanas en cultivo. DAPI, en azul, muestra los núcleos celulares. Magnificación 40x original. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig3.jpg" /> Figura 3. Western blot que muestra la pureza de los cultivos celulares neuronales. 30 g de proteína lisados ​​de rata y humanos neuronales MBG se separaron por electroforesis y se sometió a análisis Western blot siguiendo procedimientos estándar 1. Anti-MAP-2 era un conejo policlonal de Señalización Celular (Danvers, MA), anticuerpo anti-GFAP era un anticuerpo monoclonal de ratón de Chemicon (Millipore, Billerica, MA), y el anticuerpo monoclonal de ratón anti-GRB2 anticuerpo era de Transduction Laboratories (BD Sparks, MD). GRB2 se usó como un control de carga. </p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig4.jpg" /> Figura 4. Imágenes representativas de los cinco días in vitro (DIV5), las neuronas corticales de rata obtenidos a partir de cortezas que quedan en hibernación E + B27 a 4 ° C durante una semana después de la disección. A) Fase de contraste de las neuronas cultivadas en un vaso de doble cámara de diapositivas. Magnificación original 20X. B) La inmunofluorescencia muestra la expresión de MAP-2 en los procesos neuronales, en verde, el cultivo fue negativo para el marcador de astrocitos GFAP. DAPI, en azul, indica que los núcleos celulares. Magnificación 40x original.

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	<li>Aprea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin-mediated+binding+of+human+immunodeficiency+virus-1+Tat+to+the+cytoskeleton+causes+proteasomal-dependent+degradation+of+microtubule-associated+protein+2+and+neuronal+damage.">Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage.</a> J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).</li><li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+culture+of+rat+post-natal+and+fetal+brainstem+neurons.">Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).</li><li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+serum-free+culture+of+late+fetal+and+early+postnatal+rat+brainstem+neurons.">Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li><li>Eletto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SNAP25+expression+by+HIV-1+Tat+involves+the+activity+of+mir-128a.">Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a.</a> J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).</li><li>Gualco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-IR-dependent+expression+of+Survivin+is+required+for+T-antigen-mediated+protection+from+apoptosis+and+proliferation+of+neural+progenitors.">IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors.</a> Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+differentiation+of+adult+neuronal+progenitor+cells+transplanted+to+the+adult+brain.">Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).</li><li>Keyser, D. O., Pellmar, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+in+the+hippocampus:+critical+role+for+glial+cells.">Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells.</a> Glia. 10, 237-243 (1994).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 (1997).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de disección y cultivo de las neuronas del hipocampo de rata y cortical aquí descrito permite la realización de experimentos utilizando cultivos neuronales casi puros cultivadas en un medio químicamente definido (Figura 3). Aunque los protocolos para el cultivo de las neuronas casi puros en medios libres de suero han sido descritas previamente 2,3,4, hay cambios importantes realizados en nuestro método. A diferencia de los protocolos tradicionales (es decir, Banker et al.) <su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> 98% </td></tr><tr><td> B27 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 0,5 mM </td></tr></tbody></table> Tabla I. Neurobasal/B27 medio completo. <table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 16 mM </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> 22 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 160 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 2 </td><td> 0,22 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 50 g / ml </td></tr&gt; <tr><td> Fungizone </td><td> 250 ng / ml </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> Osmolaridad </td><td> 320-330 mOsm </td></tr></tbody></table> Tabla II. Disección medio. <table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (l) </td></tr><tr><td> Neurobasal/B27 medio completo </td><td> 240 </td></tr><tr><td> Trypan mancha azul del 0,4% </td><td> 250 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 490 </td></tr></tbody></table> Tabla III. Contando 50x solución. <table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Cat. número </td></tr><tr><td> Hibernate E </td><td> Brainbits </td><td> 767171 </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> La gentamicina sulfato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td></tr><tr><td> Glutamax 200 mM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> TrypLE expreso w / o rojo fenol </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 12604 </td></tr><tr><td> Citosina-β-D-arabinofuranosido clorhidrato de </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6645 </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> La laminina 1 mg / ml </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Trypan mancha azul del 0,4% </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15250 </td></tr></tbody></table&gt; Tabla IV. Reactivos específicos. <table border="1"><tbody><tr><td> Equipo </td><td> Empresa </td><td> Cat. número </td></tr><tr><td> Microscopio estéreo </td><td> Olimpo </td><td> SZ61 </td></tr><tr><td> Pinzas Grandes </td><td> FST </td><td> 11022-14 </td></tr><tr><td> Una pinza fina </td><td> Moria </td><td> MC40B </td></tr><tr><td> Micro pinzas de punta fina </td><td> Moria </td><td> MC31 </td></tr><tr><td> Afiladas tijeras </td><td> Roboz </td><td> RS-6820 </td></tr><tr><td> Micro tijeras de disección </td><td> FST </td><td> 91460-11 </td></tr><tr><td> Micro Tijeras de disección curvas </td><td> FST </td><td> 14067-11 </td></tr><tr><td> Vidrio 2-cámara portaobjetos </td><td> Lab-Tek </td><td> 154461 </td></tr><tr><td> Placas de 60 mm </td&gt; <td> BD Falcon </td><td> 353002 </td></tr><tr><td> Placas de 100 mm </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 15 ml tubos </td><td> BD Falcon </td><td> 352099 </td></tr><tr><td> 1,5 ml de la crio-tubo vial </td><td> Nunc </td><td> 375353 </td></tr></tbody></table> Tabla V. Equipos específicos.

isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol

Estamos describiendo un método rápido para disociar y la cultura de las neuronas del hipocampo o la corteza a partir de embriones de rata E15-17. El procedimiento se puede aplicar con éxito para el aislamiento de ratón y humanos neuronas primarias y progenitores neurales. Neuronas disociadas se mantienen en medio libre de suero hasta varias semanas. Estos cultivos pueden ser utilizados para nucleofection, inmunocitoquímica, la preparación de ácidos nucleicos, así como la electrofisiología. Mayores cultivos neuronales también pueden ser transfectadas con una tasa de eficiencia bueno por transducción lentiviral y, menos eficiente, con fosfato de calcio o basados ​​en lípidos métodos tales como lipofectamina.

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Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Se describe un método rápido para aislar y cultivar las neuronas del hipocampo y la corteza a partir de embriones de roedores. Este protocolo nos permite realizar experimentos en los que los cultivos neuronales casi puros son necesarios.

Aislamiento y cultivo de células neuronales de ratas embrionarias: un protocolo rápido

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

isolation-and-culture-of-rat-embryonic-neural-cells-a-quick-protocol

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

38.1K vistas.  LSU Health Sciences Center - New Orleans. Se describe un método rápido para aislar y cultivar las neuronas del hipocampo y la corteza a partir de embriones de roedores. Este protocolo nos permite realizar experimentos en los que los cultivos neuronales casi puros son necesarios.

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Neurociencias

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Disección de Local Ca2 + señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca2 + indicadores

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparación de suero de rata Adecuado para mamíferos Whole cultivo de embriones

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Biología

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, neurons and Schwann cells engage in a complex interaction to control the myelination of axons. Disturbances of this interaction and breakdown of the myelin sheath are hallmarks of inflammatory neuropathies and occur secondarily in neurodegenerative disorders. Here, we present a coculture model of dorsal root ganglion explants and Schwann cells, which develops a robust myelination of peripheral axons to investigate the process of myelination in the peripheral nervous system, study axon-Schwann cell interactions, and evaluate the potential effects of therapeutic agents on each cell type separately. Methodologically, dorsal root ganglions of embryonic rats (E13.5) were harvested, dissociated from their surrounding tissue, and cultured as whole explants for 3 days. Schwann cells were isolated from 3-week-old adult rats, and sciatic nerves were enzymatically digested. The resulting Schwann cells were purified by magnetic-activated cell sorting and cultured under neuregulin and forskolin-enriched conditions. After 3 days of dorsal root ganglion explant culture, 30,000 Schwann cells were added to one dorsal root ganglion explant in a medium containing ascorbic acid. The first signs of myelination were detected on day 10 of coculture, through scattered signals for myelin basic protein in immunocytochemical staining. From day 14 onward, myelin sheaths were formed and propagated along the axons. Myelination can be quantified by myelin basic protein staining as a ratio of the myelination area and axon area, to account for the differences in axonal density. This model provides experimental opportunities to study various aspects of peripheral myelination in vitro, which is crucial for understanding the pathology of and possible treatment opportunities for demyelination and neurodegeneration in inflammatory and neurodegenerative diseases of the peripheral nervous system.

In the coculture system of dorsal root ganglia and Schwann cells, myelination of the peripheral nervous system can be studied. This model provides experimental opportunities to observe and quantify peripheral myelination and to study the effects of compounds of interest on the myelin sheath.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

"Ordeño cerebral" de ratas para el aislamiento de células progenitoras de oligodendrocitos y tronco neural

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new neurons and glia. One such niche is the subependymal zone (SEZ; also called the ventricular-subventricular zone), which is located across the lateral walls of the lateral ventricles, adjacent to the ependymal cell layer. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are abundantly distributed throughout the central nervous system, constituting a pool of proliferative progenitor cells that can generate oligodendrocytes.
Both NSCs and OPCs exhibit self-renewal potential and quiescence/activation cycles. Due to their location, the isolation and experimental investigation of these cells is performed postmortem. Here, we describe in detail &#34;brain milking&#34;, a method for the isolation of NSCs and OPCs, amongst other cells, from live animals. This is a two-step protocol designed for use in rodents and tested in rats. First, cells are &#34;released&#34; from the tissue via stereotaxic intracerebroventricular (i.c.v.) injection of a &#34;release cocktail&#34;. The main components are neuraminidase, which targets ependymal cells and induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor-2. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid are performed from the cisterna magna, in anesthetized rats without the need of an incision.
Results presented here show that isolated cells retain their endogenous profile and that NSCs of the SEZ preserve their quiescence. The denudation of the ependymal layer is restricted to the anatomical level of injection and the protocol (release and collection) is tolerated well&#160; by the animals. This novel approach paves the way for performing longitudinal studies of endogenous neurogenesis and gliogenesis in experimental animals.

Autor destacado: Recolección de células madre neurales y progenitoras de animales vivos utilizando un novedoso protocolo de ordeño cerebral 

A method for the isolation of neural stem cells and oligodendrocyte progenitor cells from the brains of live rats is presented here in experimental detail. It allows multiple collections of these cells from the same animals without compromising their well-being.

El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...

Aislamiento y cultivo de células neuronales de ratas embrionarias: un protocolo rápido

Resumen

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Capítulos en este video

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Disección de Local Ca^{2 +} señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca^{2 +} indicadores

Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

Preparación de suero de rata Adecuado para mamíferos Whole cultivo de embriones

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas