Medición del potencial de membrana mitocondrial in vivo utilizando un indicador de voltaje codificado genéticamente

Este protocolo describe la aplicación de indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI) dirigidos a mitocondrias. Estos GEVI ofrecen una ventaja significativa sobre los colorantes tradicionales de potencial de membrana mitocondrial al permitir el monitoreo específico, in vivo y en tiempo real del potencial de membrana mitocondrial.

El potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨ_m) es crítico para las funciones mitocondriales, incluida la síntesis de ATP, el transporte de iones, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la importación de proteínas codificadas por el núcleo. Los métodos existentes para medir ΔΨ_m suelen utilizar colorantes catiónicos lipofílicos, como la rodamina 800 y el éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), pero están limitados por su baja especificidad y no son adecuados para aplicaciones in vivo . Para abordar estas limitaciones, hemos desarrollado un protocolo novedoso que utiliza indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI). Los indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI), que generan señales fluorescentes en respuesta a cambios en el potencial de la membrana, han demostrado un potencial significativo para monitorear los potenciales de la membrana plasmática y neuronales. Sin embargo, su aplicación a las membranas mitocondriales sigue sin explorarse. Aquí, desarrollamos GEVI basados en proteínas dirigidos a mitocondriales capaces de detectar fluctuaciones de ΔΨm en las células y la corteza motora de animales vivos. El indicador de potencial mitocondrial (MPI) ofrece un enfoque no invasivo para estudiar la dinámica de ΔΨ_m en tiempo real, proporcionando un método para investigar la función mitocondrial tanto en condiciones normales como patológicas.

Las mitocondrias son orgánulos esenciales en las células eucariotas, que sirven como proveedores primarios de energía a través de la generación de trifosfato de adenosina (ATP), al tiempo que realizan una variedad de otras funciones cruciales, como la síntesis de metabolitos, la amortiguación de iones de calcio, la producción de calor y la regulación^{de la supervivencia} celular. Sus funciones son particularmente críticas en tejidos altamente metabólicos como el cerebro y el corazón, donde ayudan a mantener la homeostasis celular. El potencial de membrana mitocondrial (MMP, Ψ_m) es fundamental para estos procesos, incluyendo el impulso de la síntesis de ATP a través de la fosforilación oxidativa, facilitando el transporte de metabolitos e iones a través de las membranas mitocondriales y contribuyendo a la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS)^2,3. La MMP también influye en la morfología y dinámica mitocondrial⁴, incluyendo la mitofagia (la degradación selectiva de las mitocondrias)⁵y la apoptosis (muerte celular programada)⁶. Mantener un Ψ_m adecuado es esencial para la función celular; Su desregulación está relacionada con numerosas patologías, como enfermedades neurodegenerativas, insuficiencia cardíaca y cáncer. Los métodos actuales para medir Ψ_m se basaban principalmente en el uso de colorantes catiónicos lipofílicos, incluidos TMRM (éster metílico de tetrametilrodamina), TMRE (éster etílico de tetrametilrodamina), rodamina 123, safranina O, rodamina 800, DiOC6, JC-1, ^etc.7. Sin embargo, estas moléculas fluorescentes tienen varias limitaciones. Estos tintes carecen de especificidad celular, son susceptibles de extinción y algunos son tóxicos. Además, pueden difundirse con el tiempo, y cuando se pierde el ΔΨ mitocondrial, se fugan, lo que las hace incapaces de indicar el potencial de membrana de las mitocondrias despolarizadas. Además, los colorantes a base de rodamina como TMRM y TMRE son sensibles a la temperatura⁸, lo que requiere una consideración cuidadosa de los efectos de la temperatura en la fluorescencia del tinte, particularmente cuando se mide el voltaje de la membrana mitocondrial durante actividades fisiológicas que involucran termogénesis celular.

Los indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI), proteínas capaces de detectar cambios en el potencial de membrana a través de señales fluorescentes ^9,10, han surgido como herramientas poderosas para monitorear los potenciales de membrana en una variedad de contextos celulares¹¹. Si bien los GEVI se han aplicado ampliamente para estudiar las membranas plasmáticas, ha habido poco progreso en su adaptación para medir los potenciales de membrana intracelular, particularmente para las mitocondrias. Este protocolo busca abordar esta brecha mediante el uso de GEVI dirigidos a mitocondrias que podrían monitorear el potencial de la membrana mitocondrial in vitro e in vivo. Al agregar la secuencia de señales mitocondriales a los GEVI existentes, se puede dirigir el GEVI apropiado a las mitocondrias¹². Estos indicadores de potencial mitocondrial (MPI, por sus siglas en inglés) proporcionarían nuevos conocimientos sobre la fisiología mitocondrial y ofrecerían un potencial significativo para explorar la función mitocondrial en varios estados de enfermedad in vivo, mejorando nuestra comprensión de cómo la dinámica mitocondrial contribuye a los procesos celulares normales y patológicos.

Todos los cuidados y experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Zhengzhou. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos antes de usarlos. Siga técnicas asépticas para prevenir infecciones. Una vez obtenidos todos los datos, los animales fueron sacrificados mediante una sobredosis de anestesia inhalante seguida de la decapitación.

1. Aplicaciones in vitro

1. Construcción de plásmidos
   1. Obtener el sensor acelerado de los genes de potenciales de acción 1 (ASAP1) y ASAP3 a partir de Addgene o sintetizando a partir de la secuencia. (ASAP1, ID de acceso NCBI: AHV90412.1, ID de Addgene: 52519; ASAP3, ID de Addgene: 132331).
   2. Utilice los cebadores enumerados en la Tabla 1 para construcciones de plásmidos.
   3. Para la expresión en células, utilice el vector EGFPN1 para la construcción.
      1. Inicialmente, sintetizar la secuencia del gen cox8 (NP_004065, aminoácidos 1-29) con cuatro repeticiones en tándem (4cox8) flanqueadas por sitios de restricción NheI y XhoI. Digiera tanto el fragmento 4cox8 sintetizado como el vector EGFPN1 con NheI y XhoI, seguido de la ligadura para generar el vector 4cox8-EGFP.
      2. Posteriormente, realice la amplificación por PCR de la secuencia ASAP1 con cebador 1 y cebador 2. Digiera el fragmento ASAP1 y el vector 4cox8-EGFP con SalI y NotI, seguido de la ligadura para generar el vector MPI-1 final (MPI significa indicador de potencial mitocondrial).
         NOTA: El mapa vectorial de CMV-MPI-1 se muestra en la Figura 1. Se puede acceder a la secuencia detallada desde NCBI (ID de acceso: PQ678920).
   4. Para la expresión específica en neuronas, realice la amplificación por PCR de la secuencia promotora de hSyn del plásmido AAV-hSyn-EGFP (NCBI Accession ID: MH458079, Addgene ID: 50465) utilizando el cebador 3 y el cebador 4.
      1. Digiera tanto la secuencia hSyn como el vector 4cox8-EGFP con AseI y NheI, seguido de la ligadura para generar el vector hSyn-4cox8-EGFP. Posteriormente, realice la amplificación por PCR de la secuencia ASAP3 con cebador 1 y cebador 2.
      2. Digiera el vector hSyn-4cox8-EGFP y la secuencia ASAP3 con SalI y NotI, seguido de la ligadura para generar el vector hSyn-MPI-2.
         NOTA: Las condiciones de PCR variarán en función de las enzimas específicas y las temperaturas de fusión del cebador (Tm). Una reacción típica de PCR implica un paso inicial de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, seguido de 25-35 ciclos de desnaturalización (95 °C, 10 s), recocido (55 °C, 30 s) y extensión (72 °C, 30 s/kb). Un último paso de extensión a 72 °C durante 5 minutos garantiza una síntesis completa del producto, seguido de una retención a 4 °C. La temperatura de recocido debe estar aproximadamente 5 °C por debajo de la Tm de los cebadores. Consulte las instrucciones del fabricante para conocer los parámetros óptimos de PCR. Los cebadores para ASAP1 y ASAP3 son idénticos.
2. Obtención de imágenes en células vivas
   1. Prepare el medio de cultivo DMEM añadiendo un 10% de suero fetal bovino y 100 mg/L de penicilina/estreptomicina al medio.
   2. Prepare reactivos de transfección Ca²⁺ : 2,5 mol/L CaCl₂, 2x HEBS (274 mmol/L NaCl, 10 mmol/L KCl, 1,4 mmol/L Na₂HPO₄, 15 mmol/L D-glucosa, 42 mmol/L HEPES, pH 7,07).
   3. Prepare el tampón de Tyrode para mantener las células durante la obtención de imágenes (145 mmol/L de NaCl, 3 mmol/L de KCl, 10 mmol/L de HEPES, 10 mmol/L de glucosa, pH 7,4).
   4. Cultivo de células Hela en una placa de cultivo de 35 mm alimentada con medio de cultivo DMEM en una incubadora con una temperatura de 37 °C y una atmósfera de 5% CO₂/95% de aire. Agregue 2-3 cubreobjetos por plato para permitir que las células crezcan en ellos.
   5. Transfectar las células Hela mediante el método de precipitación de fosfato de calcio.
      1. Para transfectar las células, comience por reemplazar el medio de cultivo antiguo con 2 mL de DMEM sin suero. Después de 35 minutos, prepare la solución de ADN/Ca²⁺ mezclando 10 μg de ADN, 4 μL de CaCl₂ y ddH₂O hasta un volumen final de 40 μL en un tubo de microcentrífuga.
      2. Añadir 40 μL de 2x HEBS a la solución de ADN/Ca²⁺ gota a gota mientras se agita vigorosamente. Burbuja aire con una pipeta en la mezcla para facilitar la precipitación de fosfato de calcio.
      3. Después de 25 minutos, agregue 80 μL de esta solución precipitada a la placa con las celdas y devuélvala a la incubadora durante otras 1-2 h. A continuación, retire el DMEM no sérico y enjuague las células con glicerol al 15% (disuelto en PBS) durante 2 minutos.
      4. Después de aspirar el glicerol, agregue 2 mL de DMEM que contenga un 10% de FBS y continúe cultivando las células durante 16-24 h.
   6. Coloque cubreobjetos con células en una placa de cultivo de 35 mm con 2 mL de tampón Tyrode y tiña las células con colorante de rodamina 800 añadiendo 20 μmol/L de rodamina 800 (disuelta en ddH₂O) a la placa hasta una concentración final de 50 nmol/L.
   7. Prepare un microscopio de fluorescencia y configúrelo con los filtros y la fuente de luz adecuados para excitar la proteína con una fuente de luz de 488 nm y recoger la emisión entre 490-540 nm. Excite el tinte de rodamina 800 con una fuente de luz de 633 nm y recoja la emisión entre 650-720 nm.
   8. Prepare una solución de cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona (CCCP) a 500 μM (stock) y agregue a las células hasta una concentración final de 5 μM durante la toma de imágenes.
      NOTA: El pH de la solución 2x HEBS es crucial para la eficiencia de la transfección. El pH debe ajustarse cuidadosamente a 7.07 con hidróxido de sodio sólido. El pH no puede ser inferior a 7,01 ni superior a 7,12.

Figura 1: Mapa vectorial de CMV-MPI-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Aplicaciones in vivo

1. Construcción de plásmido
   1. Para la expresión in vivo , utilice el virus AAV para la transducción. Obtenga la columna vertebral de expresión para el empaquetado de AAV (Addgene ID: 46954 o 26968), que contiene secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) para el empaquetado de virus AAV.
   2. Realice la amplificación por PCR del vector hSyn-MPI-2 (del paso 1.1.4) utilizando los cebadores 5 y 7 de la Tabla 1.
   3. Realice una segunda amplificación por PCR utilizando la misma plantilla y los cebadores 6 y 8 de la Tabla 1.
   4. Realice una PCR final utilizando el producto de la primera y la segunda PCR (pasos 2.1.2 y 2.1.3) como plantilla y los cebadores 5 y 8 de la Tabla 1, generando la secuencia final de hSyn-MPI-2.
   5. Digiera la secuencia hSyn-MPI-2 y la columna vertebral de pAAV con MluI y EcoRI, seguida de la ligadura para generar la construcción final de pAAV-hSyn-MPI-2. El mapa vectorial de pAAV-hSyn-MPI-2 se ilustra en la Figura 2. Se puede acceder a la secuencia detallada desde NCBI (ID de acceso: PQ678919).
      NOTA: El vector hSyn-MPI-2 contiene un sitio EcoRI interno que se origina en la red troncal EGFPN1 original, que se elimina utilizando cebadores modificados en una estrategia de PCR superpuesta (pasos 2.1.2-2.1.4).
2. Preparación y transducción de virus
   1. Cultivo de células HEK293t en una placa de cultivo de 100 mm alimentada con medio de cultivo FBS DMEM al 10% en una incubadora con una temperatura de 37 °C y una atmósfera de 5% de CO₂/95% de aire para alcanzar una confluencia del 70%.
   2. Co-transfecte las células HEK293t con plásmido del gen AAV, cápside (pAAV-DJ o pAAV9) y plásmidos auxiliares (pHelper) utilizando el método de precipitación de fosfato de calcio. La cantidad de ADN para cada plásmido fue la siguiente: gen: 10 μg, pHelper: 11 μg, cápside: 9 μg. La cantidad de reactivo de transfección: 12 μL de CaCl₂, 120 μL de 2x HEBS.
   3. Incubar las células transfectadas durante un período de 72 h para permitir la producción del virus.
   4. Después del período de incubación, recoja las células por centrífuga a 400 g. Enjuague las células con PBS 2 veces y vuelva a suspender la célula en 400 μL de PBS.
   5. Cosecha los virus de la suspensión celular con cuatro ciclos de métodos de congelación-descongelación (37 °C y -80 °C). Centrifugar el lisado a 13.500 × g a 4 °C y desechar el pellet. El sobrenadante contiene el virus AAV.
   6. Realice PCR en tiempo real para determinar la valoración del virus preparado. El protocolo detallado para la determinación de la valoración de AAV se puede encontrar en https://www.addgene.org/protocols/aav-titration-qpcr-using-sybr-green-technology/.
   7. Alícuota y almacene el virus AAV preparado a -80 °C.
3. Inyección estereotáctica de virus
   1. Anestesiar un ratón macho adulto C57/BL de 24-26 g de peso con pentobarbital sódico al 3% mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 30 mg/kg. Una vez anestesiados, fije los ratones en un aparato estereotáxico para mantener una posición estable durante todo el procedimiento.
   2. Aplique ungüento oftálmico veterinario para proteger los ojos del daño de la luz y para mantener los ojos húmedos.
   3. Use crema depilatoria para eliminar el vello de la cabeza del ratón y exponer el cuero cabelludo.
   4. Abra el cuero cabelludo con unas tijeras quirúrgicas y exponga el cráneo. Trate el cráneo con peróxido de hidrógeno al 3% para esterilizar y visualizar puntos de referencia clave como los sitios bregma y lambda.
   5. Ajuste la posición de la cabeza del ratón para asegurarse de que la calavera esté horizontal.
   6. Utilice un extractor de micropipetas programable para extraer las pipetas de vidrio de la forma y el tamaño deseados para obtener inyecciones precisas. Llene la micropipeta de vidrio con aceite de parafina.
   7. Coloque la micropipeta en el lugar de destino. En este protocolo, el objetivo es la región M2 en el lado derecho, utilizando las siguientes coordenadas: AP (antero-posterior), +1,94 mm; ML (mediolateral), +0,75 mm; DV (dorsoventral), -1,5 mm.
   8. Use un taladro eléctrico para hacer un pequeño agujero en el cráneo en el sitio objetivo.
   9. Aspire 500 nL de virus a un título de 1,5 x^{10 11} copias del genoma por mililitro (GC/mL) a través de la punta de la micropipeta. Inyecte 500 nL de virus en el sitio objetivo utilizando una bomba de inyección a un caudal de 100 nL/min.
   10. Después de la inyección, deje la pipeta en su lugar durante aproximadamente 5 minutos para permitir la difusión antes de retraerla con cuidado.
   11. Implante fibra óptica (200 μm de diámetro, 0,37 de apertura numérica, 2 mm de longitud) en el lugar de la inyección.
   12. Asegure la fibra óptica en su lugar con cemento dental.
   13. Suturar el cuero cabelludo del ratón con hilo de nylon 5-0 (aguja estética Δ1/2 4x12) y devolverlo a su jaula de origen.
   14. Coloque la jaula casera sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón hasta que se recupere por completo de la anestesia.
   15. Apague la almohadilla térmica una vez que el animal comience a moverse. Espere otras 2 horas de aclimatación a la temperatura ambiente (RT) antes de transferir el mouse a la instalación de alojamiento.
   16. Ratón doméstico en un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad a 22 °C con acceso ad libitum a alimentos y agua durante 2-3 semanas para permitir la expresión viral.
4. Fotometría de fibra
   1. Conecte la fibra óptica implantada en el ratón a un cable óptico.
   2. Conecte el otro extremo del cable óptico a un detector que se utilizará para capturar los datos de imagen.
   3. Para la obtención de imágenes, utilice una fuente de luz para excitar las proteínas a una longitud de onda de 488 nm. Configure el detector para recoger la luz emitida en longitudes de onda que van desde 490 nm hasta 540 nm.
   4. Ajuste la intensidad de la luz de excitación para optimizar la señal sin causar daño al tejido cerebral.
   5. Modifique las ganancias de la señal fluorescente para garantizar que el detector capture una señal clara y fuerte.
   6. Para evitar el blanqueo rápido de la fluorescencia, que reduciría la calidad de las imágenes, ajuste la intensidad de la luz y la ganancia de la señal fluorescente según sea necesario.
   7. Realice una prueba de comportamiento del mouse.
   8. Monitoree continuamente el proceso de imágenes durante la prueba de comportamiento.
5. Análisis de datos
   1. Utilice Python y GNUplot para crear un mapa de calor de ensayos experimentales para una representación visual de los datos. Los códigos fuente se proporcionan en el Archivo Complementario 1.

Figura 2: Mapa vectorial de AAV-hSyn-MPI-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después de construir el plásmido CMV-MPI-1, se probó su capacidad para dirigirse a las mitocondrias en células Hela utilizando el marcador mitocondrial Rhodamine 800 para la tinción. Los experimentos de colocalización mostraron un alto grado de superposición entre la señal de fluorescencia de MPI-1 y la señal de Rhodamine 800, lo que indica que MPI-1 se localizó con éxito en las mitocondrias (Figura 3).

El voltaje de la membrana mitocondrial se mantiene entre -120 y 180 mV en condiciones de reposo y fluctúa con los cambios en el estado metabólico. Actualmente, la medición del potencial de membrana mitocondrial se puede realizar utilizando métodos electrofisiológicos y métodos de colorante de fluorescencia. El pinzamiento del parche mitocondrial requiere el aislamiento de las mitocondrias y la destrucción de las estructuras celulares¹³. Este enfoque puede c...

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (NSF) de China: JSK (32071137 y 92054103) y la financiación del Equipo de Investigación Científica e Innovación del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhengzhou: JSK (ZYCXTD2023014).