使用基因编码的电压指示器测量 体内 线粒体膜电位

该协议描述了线粒体靶向基因编码电压指示剂 （GEVI） 的应用。与传统的线粒体膜电位染料相比，这些 GEVI 具有显著的优势，能够特异性、 体内和实时监测线粒体膜电位。

线粒体膜电位 （MMP， ΔΨ_m） 对线粒体功能至关重要，包括 ATP 合成、离子转运、活性氧 （ROS） 生成以及细胞核编码的蛋白质的输入。现有的测量 ΔΨ_m 的方法通常使用亲脂性阳离子染料，例如罗丹明 800 和四甲基罗丹明甲酯 （TMRM），但这些方法受到低特异性的限制，不太适合 体内应用。 为了解决这些限制，我们开发了一种利用基因编码电压指示器 （GEVI） 的新协议。基因编码电压指示剂 （GEVI） 响应膜电位变化而产生荧光信号，已显示出监测质膜和神经元电位的巨大潜力。然而，它们在线粒体膜中的应用仍未得到探索。在这里，我们开发了基于蛋白质的线粒体靶向 GEVIs，能够检测活体动物细胞和运动皮层中的 ΔΨm 波动。线粒体电位指标 （MPI） 提供了一种实时研究 ΔΨ_m 动力学的非侵入性方法，提供了一种在正常和病理条件下研究线粒体功能的方法。

线粒体是真核细胞中必不可少的细胞器，通过三磷酸腺苷 （ATP） 生成作为主要能量供应者，同时还执行各种其他关键功能，例如代谢物合成、钙离子缓冲、产热和细胞存活调节¹。它们在大脑和心脏等高度代谢组织中的作用尤为关键，它们有助于维持细胞稳态。线粒体膜电位 （MMP， Ψ_m） 是这些过程的核心，包括通过氧化磷酸化驱动 ATP 合成，促进代谢物和离子穿过线粒体膜的转运，并有助于活性氧 （ROS） 的产生^2,3。MMP 还影响线粒体形态和动力学⁴，包括线粒体自噬（线粒体的选择性降解）⁵和细胞凋亡（程序性细胞死亡）⁶。维持适当的 Ψ_m 对于细胞功能至关重要;其失调与许多病症有关，包括神经退行性疾病、心力衰竭和癌症。目前测量 Ψ_m 的方法主要基于亲脂性阳离子染料的使用，包括 TMRM（四甲基罗丹明甲酯）、TMRE（四甲基罗丹明乙酯）、罗丹明 123、番红霉素 O、罗丹明 800、DiOC6、JC-1 ^等7。然而，这些荧光分子有几个局限性。这些染料缺乏细胞特异性，易淬灭，有些有毒。此外，它们会随着时间的推移而扩散，当线粒体 ΔΨ 丢失时，它们会泄漏出来，使它们无法指示去极化线粒体的膜电位。此外，TMRM 和 TMRE 等基于罗丹明的染料对温度敏感⁸，因此需要仔细考虑温度对染料荧光的影响，尤其是在涉及细胞产热的生理活动期间测量线粒体膜电压时。

基因编码电压指示剂 （GEVI） 是一种能够通过荧光信号检测膜电位变化的蛋白质 ^9,10，已成为在各种细胞环境中监测膜电位的强大工具¹¹。虽然 GEVI 已广泛用于研究质膜，但在使它们用于测量细胞内电位方面进展甚微，尤其是线粒体。该协议旨在通过使用线粒体靶向的 GEVI 来解决这一差距，这些 GEVI 可以在体外和体内监测线粒体膜电位。通过将线粒体信号序列添加到现有的 GEVI 中，适当的 GEVI 可以靶向线粒体¹²。这些线粒体电位指标 （MPI） 将为线粒体生理学提供新的见解，并为探索体内各种疾病状态下的线粒体功能提供重要潜力，增强我们对线粒体动力学如何促进正常和病理细胞过程的理解。

所有动物护理和实验均按照郑州大学机构动物护理和使用委员会指南进行。使用前对所有手术器械进行消毒。遵循无菌技术以防止感染。获得所有数据后，使用过量的吸入麻醉剂对动物实施安乐死，然后斩首。

1. 体外 应用

1. 质粒构建
   1. 从 Addgene 或从序列合成中获得动作电位 1 （ASAP1） 和 ASAP3 基因的加速传感器。（ASAP1，NCBI 登录 ID：AHV90412.1，Addgene ID：52519;ASAP3，Addgene ID：132331）。
   2. 使用 表 1 中列出的引物进行质粒构建。
   3. 对于细胞中的表达，使用 EGFPN1 载体进行构建。
      1. 最初，合成 cox8 基因序列 （NP_004065，氨基酸 1-29），具有四个串联重复序列 （4cox8），两侧是 NheI 和 XhoI 限制性位点。用 NheI 和 XhoI 消化合成的 4cox8 片段和 EGFPN1 载体，然后连接以生成 4cox8-EGFP 载体。
      2. 随后，使用引物 1 和引物 2 对 ASAP1 序列进行 PCR 扩增。用 SalI 和 NotI 消化 ASAP1 片段和 4cox8-EGFP 载体，然后连接以生成最终的 MPI-1 载体（MPI 代表线粒体电位指示剂）。
         注意：CMV-MPI-1 的矢量图如图 1 所示。详细序列可从 NCBI （Accession ID： PQ678920） 获取。
   4. 对于神经元中的特异性表达，使用引物 3 和引物 4 对 AAV-hSyn-EGFP 质粒（NCBI 登录 ID：MH458079，Addgene ID：50465）的 hSyn 启动子序列进行 PCR 扩增。
      1. 用 AseI 和 NheI 消化 hSyn 序列和 4cox8-EGFP 载体，然后连接以生成 hSyn-4cox8-EGFP 载体。随后，使用引物 1 和引物 2 对 ASAP3 序列进行 PCR 扩增。
      2. 用 SalI 和 NotI 消化 hSyn-4cox8-EGFP 载体和 ASAP3 序列，然后连接以生成 hSyn-MPI-2 载体。
         注：PCR 条件将根据特定酶和引物熔解温度 （Tm） 而有所不同。典型的 PCR 反应包括在 95 °C 下进行 30 秒的初始变性步骤，然后是 25-35 个变性循环（95 °C，10 秒）、退火（55 °C，30 秒）和延伸（72°C，30 秒/kb）。最后的延伸步骤在 72 °C 下持续 5 分钟可确保产物完全合成，然后在 4 °C 下保持。 退火温度应比引物的 Tm 低约 5 °C。请参阅制造商的说明以获得最佳 PCR 参数。ASAP1 和 ASAP3 的引物相同。
2. 活细胞成像
   1. 通过向培养基中加入 10% 胎牛血清和 100 mg/L 青霉素/链霉素来制备 DMEM 培养基。
   2. 制备 Ca²⁺ 转染试剂：2.5 mol/L CaCl₂、2x HEBS（274 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、1.4 mmol/L Na₂HPO₄、15 mmol/L D-葡萄糖、42 mmol/L HEPES，pH 7.07）。
   3. 准备 Tyrode 缓冲液以在成像过程中维持细胞（145 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、10 mmol/L 葡萄糖，pH 7.4）。
   4. 在 35 mm 培养皿中培养 Hela 细胞，培养皿中加入 DMEM 培养基，培养箱温度为 37 °C，气氛为 5% CO₂/95% 空气。每个培养皿添加 2-3 个盖玻片，以使细胞在其上生长。
   5. 通过磷酸钙沉淀法转染 Hela 细胞。
      1. 要转染细胞，首先用 2 mL 无血清 DMEM 替换旧培养基。35 分钟后，通过在微量离心管中混合 10 μg DNA、4 μL CaCl₂ 和 ddH₂O 至最终体积为 40 μL 来制备 DNA/Ca²⁺ 溶液。
      2. 在 DNA/Ca²⁺ 溶液中滴加 40 μL 2x HEBS，同时剧烈搅拌。用移液管将空气鼓泡到混合物中，以促进磷酸钙沉淀。
      3. 25 分钟后，将 80 μL 这种沉淀溶液添加到装有细胞的培养皿中，然后将其放回培养箱中再放置 1-2 小时。然后，去除非血清 DMEM，并用 15% 甘油（溶于 PBS）冲洗细胞 2 分钟。
      4. 吸出甘油后，加入 2 mL 含有 10% FBS 的 DMEM，并继续培养细胞 16-24 小时。
   6. 将装有细胞的盖玻片放入含有 2 mL Tyrode 缓冲液的 35 mm 培养皿中，向培养皿中加入 20 μmol/L 罗丹明 800（溶于 ddH₂O）至终浓度为 50 nmol/L，用罗丹明 800 染料对细胞进行染色。
   7. 准备荧光显微镜并设置适当的滤光片和光源，以用 488 nm 光源激发蛋白质并收集 490-540 nm 之间的发射光。用 633 nm 光源激发罗丹明 800 染料，并收集 650-720 nm 之间的发射光。
   8. 制备 500 μM（原液）的羰基氰化物间氯苯腙 （CCCP） 溶液，并在成像过程中加入细胞至终浓度为 5 μM。
      注：2x HEBS 溶液的 pH 值对于转染效率至关重要。应使用固体氢氧化钠小心调节 pH 值至 7.07。pH 值不能低于 7.01 或高于 7.12。

图 1：CMV-MPI-1 的矢量图。请单击此处查看此图的较大版本。

2. 体内 应用

1. 质粒构建体
   1. 对于 体内 表达，使用 AAV 病毒进行转导。获得 AAV 包装的表达骨架（Addgene ID：46954 或 26968），其中包含用于 AAV 病毒包装的倒置末端重复序列 （ITR） 序列。
   2. 使用 表 1 中的引物 5 和 7 对 hSyn-MPI-2 载体（来自步骤 1.1.4）进行 PCR 扩增。
   3. 使用相同的模板和 表 1 中的引物 6 和 8 进行第二次 PCR 扩增。
   4. 使用来自第一次和第二次 PCR（步骤 2.1.2 和 2.1.3）的产物作为模板和 表 1 中的引物 5 和 8 进行最终 PCR，生成最终的 hSyn-MPI-2 序列。
   5. 用 MluI 和 EcoRI 消化 hSyn-MPI-2 序列和 pAAV 骨架，然后连接以生成最终的 pAAV-hSyn-MPI-2 构建体。pAAV-hSyn-MPI-2 的矢量图如图 2 所示。详细序列可从 NCBI 获取（Accession ID： PQ678919）。
      注：hSyn-MPI-2 载体包含一个源自原始 EGFPN1 骨架的内部 EcoRI 位点，在重叠 PCR 策略中使用修饰的引物将其去除（步骤 2.1.2-2.1.4）。
2. 病毒制备和转导
   1. 在 100 mm 培养皿中培养 HEK293t 细胞，该培养皿在 37 °C 的温度和 5% CO₂/95% 空气的气氛中用 10% FBS DMEM 培养基喂养，以达到 70% 汇合。
   2. 使用磷酸钙沉淀法，用 AAV 基因质粒、衣壳（pAAV-DJ 或 pAAV9）和辅助质粒（pHelper）共转染 HEK293t 细胞。每个质粒的 DNA 量如下：基因：10 μg，pHelper：11 μg，衣壳：9 μg。转染试剂量：12 μL CaCl 2,120 μL 2x HEBS。
   3. 将转染的细胞孵育 72 小时以产生病毒。
   4. 孵育期后，通过以 400 g 离心机收获细胞。用 PBS 冲洗细胞 2 次，并将细胞重悬于 400 μL PBS 中。
   5. 用四次冻融法（37°C和-80°C）循环从细胞悬液中收获病毒。在 4 °C 下以 13,500 × g 离心裂解物并弃去沉淀。上清液含有 AAV 病毒。
   6. 进行实时 PCR 以确定制备病毒的滴定。AAV 滴定测定的详细方案可在 https://www.addgene.org/protocols/aav-titration-qpcr-using-sybr-green-technology/ 中找到。
   7. 将制备好的 AAV 病毒分装并储存在 -80 °C。
3. 立体定向病毒注射
   1. 通过腹膜内注射以 30 mg/kg 的剂量麻醉体重 24-26 g 和 3% 戊巴比妥钠的成年 C57/BL 雄性小鼠。麻醉后，将小鼠固定在立体定位装置上，以在整个过程中保持稳定的位置。
   2. 涂抹兽用眼药膏以保护眼睛免受光损伤并保持眼睛湿润。
   3. 使用脱毛霜去除小鼠头上的毛发并露出头皮。
   4. 用手术剪刀打开头皮，露出头骨。用 3% 的过氧化氢处理颅骨，以消毒并可视化关键标志，例如前囟和 lambda 部位。
   5. 调整鼠标头部的位置，确保头骨水平。
   6. 使用可编程微量移液器拉拔器将玻璃移液器拉至所需的形状和尺寸，以进行精确注射。用石蜡油填充玻璃微量移液器。
   7. 将微量移液器放置在目标部位。在该协议中，目标是右侧的 M2 区域，使用以下坐标：AP（前后），+1.94 毫米;ML（中外侧），+0.75 毫米;DV（背腹），-1.5 毫米。
   8. 使用电钻在目标部位的颅骨上打一个小孔。
   9. 通过微量移液管的尖端以 1.5 x 10¹¹ 基因组拷贝/毫升 （GC/mL） 的滴度吸取 500 nL 病毒。使用注射泵以 100 nL/min 的流速将 500 nL 病毒注入目标部位。
   10. 注射后，将移液器留在原位约 5 分钟以允许扩散，然后小心地缩回。
   11. 将光纤（直径 200 μm，数值孔径 0.37，长度 2 mm）注入注射部位。
   12. 使用牙科粘结剂将光纤固定到位。
   13. 用 5-0 尼龙线（美容针 Δ1/2 4x12）缝合小鼠的头皮，然后将其放回笼子。
   14. 将家笼放在加热垫上，以保持鼠标的体温，直到它从麻醉中完全恢复。
   15. 一旦动物开始四处走动，请关闭加热垫。在将鼠标转移到住房设施之前，再适应室温 （RT） 2 小时。
   16. 家鼠在 22 °C 下进行 12 小时光照/12 小时黑暗循环，随意获取食物和水 2-3 周，以允许病毒表达。
4. 光纤光度法
   1. 将植入鼠标中的光纤连接到光缆。
   2. 将光缆的另一端连接到将用于捕获成像数据的探测器。
   3. 对于成像，使用光源激发 488 nm 波长的蛋白质。设置检测器以收集波长范围为 490 nm 至 540 nm 的发射光。
   4. 调整激发光的强度以优化信号，而不会对脑组织造成损害。
   5. 修改荧光信号的增益，以确保检测器捕获清晰而强烈的信号。
   6. 为避免荧光快速漂白，这会降低成像质量，请根据需要微调荧光信号的光强度和增益。
   7. 进行鼠标行为测试。
   8. 在行为测试期间持续监测成像过程。
5. 数据分析
   1. 使用 Python 和 GNUplot 创建实验试验的热图，以直观地表示数据。补充 文件 1 中提供了源代码。

图 2：AAV-hSyn-MPI-2 的矢量图。请单击此处查看此图的较大版本。

构建 CMV-MPI-1 质粒后，使用线粒体标志物 Rhodamine 800 在 Hela 细胞中测试其靶向线粒体的能力进行染色。共定位实验显示，MPI-1 的荧光信号与罗丹明 800 的信号高度重叠，表明 MPI-1 成功定位到线粒体（图 3）。

图 3

线粒体膜电压在静息条件下维持在 -120--180 mV，并随代谢状态的变化而波动。目前，可以使用电生理学方法和荧光染料方法进行线粒体膜电位的测量。线粒体膜片钳需要分离线粒体和破坏细胞结构¹³。这种方法可能会导致测量结果偏离生理条件。荧光探针法是 MMP 测量的常用方法。然而，这些荧光分子不能对特定细胞进行染色，容易猝灭，并且某些染料有?...

作者没有什么可披露的。

我们感谢中国国家自然科学基金 （NSF） JSK（32071137 和 92054103）的支持以及郑州大学第一附属医院科学研究和创新团队 JSK （ZYCXTD2023014） 的资助。