Producción de ratón humanizado mediante injerto de cápsula renal tímica, inyección de células CD34⁺ y administración de citocinas

Los modelos de ratón humanizados proporcionan una representación más precisa del microambiente inmunitario humano. Este manuscrito describe el proceso en el que se crean estos modelos a través de un injerto renal de timo humano, la inyección de células CD34⁺ humanas y la administración dirigida de transgenes de citocinas humanas para promover la proliferación y diferenciación de células CD34⁺ .

Los modelos animales proporcionan una traducción vital entre la investigación biomédica in vitro e in vivo . Los modelos de ratón humanizados proporcionan un puente en la representación de los sistemas humanos, lo que permite un estudio más preciso de la patogénesis, los biomarcadores y muchas otras preguntas científicas. En este método descrito, a los ratones inmunodeficientes NOD-scid IL2Rγnull (NSG) se les implanta timo autólogo, se les inyectan células CD34⁺ derivadas del hígado seguidas de una serie de entregas de citocinas inyectadas. A diferencia de otros modelos de naturaleza similar, el modelo descrito aquí promueve una mejor reconstitución de las células inmunitarias mediante la administración de citocinas y factores de crecimiento a través de transgenes codificados en vectores basados en ADN AAV8 o pMV101. Además, ofrece estabilidad a largo plazo con ratones reconstituidos que tienen una vida media de 30 semanas después de las inyecciones de CD34⁺ . A través de este modelo, esperamos proporcionar un método estable e impactante para estudiar la inmunoterapia y la enfermedad humana en un modelo murino, demostrando así la necesidad de modelos preclínicos predictivos.

Si bien los modelos animales han creado una comprensión más profunda de los sistemas celulares y moleculares, el desafío sigue siendo dilucidar las complejidades de los sistemas específicos de la especie, como la inmunidad, la fisiología y otras áreas de patología. Los primates no humanos (NHP), como los chimpancés, se han utilizado históricamente para compensar las lagunas en la investigación de modelos; sin embargo, el modelo NHP puede ser bastante costoso e inaccesible, sobre todo porque su uso ha sido prohibido en Europa¹.

Después de un procedimiento de injerto exitoso, el sistema murino replica el sistema inmunológico humano, como se demuestra a través de la repoblación de los órganos linfoides. El desarrollo de ratones con sistemas inmunológicos humanos funcionales brinda la oportunidad de realizar investigaciones traslacionales sobre la inmunidad humana en una variedad de contextos. Los ratones inmunodeficientes injertados con células y tejidos humanos que pueden replicar con éxito un sistema inmunológico humano operativo facilitan el estudio de la hematopoyesis, la inmunidad, la terapia génica², las enfermedades infecciosas³, el cáncer⁴ y la medicina regenerativa⁵. Nuestro grupo y algunos de nuestros colaboradores han publicado resultados utilizando este modelo que muestran modelos preclínicos de melanoma cutáneo⁶. Este modelo es lo suficientemente versátil como para ser aplicado a innumerables campos más allá del contexto de la investigación en melanoma e inmunoterapia.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se utilizan comúnmente para la humanización, ya que dan lugar a una reconstitución robusta de las células T, que tienen funciones establecidas en la tolerancia inmunitaria; sin embargo, debido a su baja tasa de autorrenovación y su alta tasa de células maduras comprometidas con el linaje, las PBMC a menudo se reemplazan con productos basados en células madre humanas (HSC), que se pueden derivar del hígado fetal⁷. En combinación con estos productos derivados de HSC, la adición de implantar el timo humano debajo de las cápsulas renales de ratones NSG crea un sistema capaz de apoyar el desarrollo de las células T humanas. Este modelo, conocido como médula ósea-hígado-timo (BLT), es altamente ventajoso porque permite la hematopoyesis multilinaje, la educación de células T en el timo autólogo y la restricción de HLA⁸.

El modelo propuesto en este manuscrito es un modelo BLT modificado con administración adicional de citocinas. Se ha demostrado que las citocinas proinflamatorias refuerzan las capacidades de las células inmunitarias efectoras, específicamente a través de inmunoterapias basadas en IL-15⁹. Los linfocitos CD45⁺ se observan en la sangre periférica de ratones humanizados (Hu-ratones) aproximadamente 8-12 semanas después de la inyección de células CD34⁺ humanas, mostrando un aumento evidente en la reconstitución en comparación con la sangre circulante de los ratones NSG normales. Utilizando el vector adenoasociado para administrar IL-3, IL-7 y GM-CSF humanos, los niveles de células CD45⁺ humanas aumentaron en circulación en comparación con los ratones que no recibieron las citocinas. La adición de las citocinas AD COMBO II (SCF, FLT3, CKIT y THPO) mejora la diferenciación de las células T y las células mieloides¹⁰. La adición de la administración de citocinas distingue este método entre los otros modelos de Hu-micones, como lo respaldan los datos publicados¹⁰.

El desarrollo de este modelo con una respuesta inmune humana innata y adaptativa ha permitido publicar datos sobre la resistencia a la terapia y el microambiente tumoral¹⁰. Siempre que los laboratorios puedan acceder a muestras de tejido para utilizar este método; este modelo de ratones Hu tiene un gran potencial para que otros laboratorios estudien campos similares, así como para expandirse a otras áreas de la inmunoterapia y los estudios preclínicos.

Todos los protocolos que involucran el uso de animales son monitoreados de cerca por el Comité Institucional de Usuarios y Cuidado de Animales (IACUC) del Instituto Wistar. El laboratorio se adhiere a las pautas establecidas por este comité y el veterinario tratante para garantizar la salud, la seguridad y el bienestar de los animales involucrados. Antes de seguir este protocolo, se requiere la aprobación del veterinario y de la IACUC, y las personas pueden tener variaciones en las técnicas quirúrgicas específicas y el manejo de los animales en comparación con el protocolo según el consejo de las partes involucradas en el bienestar animal antes mencionadas.

NOTA: Las muestras de tejido se pueden congelar hasta que estén listas para su uso. Además, el aislamiento de CD34⁺ se puede realizar el mismo día o al día siguiente de la cirugía de injerto renal. Esta información informará cuándo se inyectará Busulfán: si tiene la intención de realizar una cirugía el mismo día del aislamiento, el Busulfán debe inyectarse de forma preventiva en preparación para el tejido receptor. Tratar a treinta ratones hembra NSG de 5-7 semanas de edad con 30 mg/kg (100 μL, PBS 1x) de un fármaco mielodepletor recién fabricado; Busulfan inyectado IP 24 h antes de la cirugía.

1. Aislamiento de células CD34⁺

1. Prepare la solución de digestión disolviendo 100 mg de colagenasa/dispasa en 50 ml de RPMI1640. Utilice un filtro de vacío de 0,22 μm para esterilizar la solución de digestión.
2. El hígado fetal (>20 semanas de edad) se proporciona en 50 mL de medio RPMI1640. Aspire y deseche el medio, dejando 10 mL dentro del tubo que contiene el hígado.
3. Lave el pañuelo con 45 mL de RPMI1640 + 100 μg/mL del antibiótico Primocin dos veces en un tubo cónico de 50 mL, aspirando el medio entre cada lavado. Asegúrese de dejar que el pañuelo se asiente en el fondo del tubo antes de aspirar el medio.
4. Coloque un tamiz de pañuelo estéril en un vaso de precipitados estéril de 200 ml.
5. Vierta el hígado fetal a través del tamiz y use el extremo de una jeringa de plástico estéril de 10 ml para moler el tejido.
6. Enjuague las células hepáticas que quedan en el tamiz con 50 mL de RPMI1640 + 100 μg/mL del antibiótico Primocina seguido de 50 mL de medio RPMI1640 colagenasa/dispasa (2 mg/mL). El vaso de precipitados de 200 ml contiene ahora el RPMI1640 con Primocina, RPMI1640 colagenasa/dispasa e hígado homogeneizado.
7. Alícuota la mezcla en cuatro tubos cónicos de 50 mL e incubarlos en un baño de agua (37 °C) durante 1 h. Agitar los tubos cónicos cada 15 min.
8. Añadir 15 mL de Ficoll en cuatro tubos cónicos de 50 mL.
9. Coloque cuidadosamente la solución hepática homogeneizada en la parte superior, distribuyendo aproximadamente 35 ml entre cada tubo. No moleste la interfaz.
10. Coloque los tubos en la centrífuga y gire a 800 x g durante 1 h con una aceleración/freno mínimos.
11. Retire los tubos de la centrífuga y recoja las células de la interfaz (10-15 mL) en dos tubos cónicos de 50 mL.
12. Agregue PBS 1x hasta 50 mL para lavar el pellet y centrifugue a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
13. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de tampón de lisis ACK (cloruro de amonio-potasio) e incube durante 5-10 min. Llene el tubo con 1x PBS.
14. Cuente manualmente las células bajo el microscopio usando azul de tripán y un hemocitómetro. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min.
    NOTA: Las células mononucleares del hígado se pueden inyectar directamente desde aquí si se desea, por ejemplo, si el recuento de células es inferior a 50 millones de células.
15. Aspire el PBS y vuelva a suspender el pellet de celda en 300 μL del tampón de separación (2 mM de EDTA, 5 μg/mL de BSA en 1x PBS) para 100 x 10⁶ celdas o menos. Para más de 100 x 10⁶ celdas, use una proporción basada en la cantidad de celdas anterior para determinar la cantidad de tampón (es decir, el doble de celdas, el doble del tampón).
16. Añadir 100 μL de reactivo bloqueante de FcR e incubar 2-5 min.
17. Añadir 100 μL de anticuerpos de microperlas CD34, mezclar bien e incubar en hielo durante 30 min; Agitar mecánicamente con la mano después de 15 min.
18. Agregue de 7 a 10 ml del tampón de separación y filtre a través de filtros de celdas de 100 μm, 70 μm y 40 μm en ese orden.
19. Coloque un separador de celdas basado en columna en un separador magnético. Coloque un tubo cónico de 15 mL debajo del separador para recoger el flujo y el tampón.
20. Llene la columna con 500 μL del tampón de separación.
21. Vierta la suspensión de la celda a través de la columna.
22. Llene la columna con el flujo y el tampón que se ha recogido en el tubo cónico.
23. Lave la columna 3 veces con 500 μL del tampón de separación.
24. Deseche el flujo y reemplace el tubo con un tubo de poliestireno de 15 mL.
25. Llene la columna con 1 mL del tampón de separación, retire la columna del imán y enjuague el émbolo de una sola vez.
26. Cuente las células y vuelva a suspender en 1x PBS para la inyección. Coloque sobre hielo hasta su uso.

2. Procesamiento tímico

1. Lave el timo autólogo (>20 semanas de edad) agregando 5-8 mL de RPMI1640, deje que el tejido se asiente. Retire con cuidado el medio al vacío evitando el contacto con el timo. Repite esto una vez más.
2. Suspender en 10 mL de RPMI1640 a temperatura ambiente con Primocin (100 μg/mL).
3. Transfiera el timo a una placa de Petri tratada con tejido. Asegúrese de que el timo esté completamente cubierto de Primocin-media.
4. Incubar durante 30-45 min a temperatura ambiente.
5. Aspire el medio Primocin. Lave el timo con 5-8 ml de RPMI1640, retire el medio al vacío y repita esto una vez más.
6. Suspender el timo en 5-8 mL de RPMI1640.
7. Prepare el timo incubado para el injerto cortando segmentos de 1 mm x 2 mm con dos bisturís.
   NOTA: Esto se injertará en los ratones; por lo tanto, asegúrese de que las rodajas de timo se puedan aspirar tanto dentro como fuera de la jeringa y de la aguja Hamilton de 22 G adjunta con relativa facilidad.

3. Injerto de cápsula subrenal e inyección de células CD34

1. Examine la salud general de los ratones antes de la cirugía. Afeita a los ratones para exponer un área (aproximadamente 3" x 2") en el lateral izquierdo del cuerpo.
2. Anestesiar a los ratones mediante isoflurano (inducción 5%, mantenimiento 2%-3%) en la cámara y luego transferir ratones individuales de la cámara a una etapa quirúrgica con un cono nasal.
3. Desinfecte el área afeitada con clorohexidina e hisopos de preparación con alcohol. Asegurar la anestesia individual a través de la prueba de pinzamiento.
4. Haga una incisión grande (5-7 mm) en la parte posterior, lateral a la columna vertebral del ratón, y pliegue la piel hacia atrás.
5. Asegúrese de que en este punto, el bazo sea visible debajo de la fascia. Haga una incisión más pequeña de ~2 mm en la fascia. Asegúrese de que la incisión sea lo más pequeña posible y permita que el riñón quede completamente expuesto.
6. Determine la ubicación de esta incisión, identificando visualmente el bazo y utilizándolo como marcador para el riñón, que no es visible.
   NOTA: El riñón murino se encuentra detrás de un grupo de grasa en el cuadrante noreste del bazo.
7. A partir de aquí, coloque la mano (cirujano) debajo del lado del ratón opuesto a la incisión y empuje para exponer el riñón. Vuelva a colocar la grasa para exponer completamente el riñón.
8. Utilice los dedos de la misma mano para estabilizar el riñón expuesto. Si es necesario, use 1x PBS estéril para lubricar el riñón expuesto.
   NOTA: Es importante tener en cuenta que el cirujano debe utilizar dedos diferentes a los que manejaban el lado del ratón para sujetar el riñón y mantener la esterilidad. Consulte con el veterinario del instituto sobre el mantenimiento adecuado de la esterilidad.
9. Al mismo tiempo, deje que el asistente prepare una jeringa roma con el tejido del timo fetal. Aspire suavemente 2-3 trozos de timo de tamaño mediano (1 mm x 2 mm) con un medio mínimo hasta la punta de la aguja y luego entrégueselo al cirujano para que realice el procedimiento.
   NOTA: El número de trozos de timo depende del tamaño del tejido, por lo general 2 trozos son suficientes para obtener ratones humanizados.
10. Deje que el cirujano inserte la aguja a través del extremo caudal de la cápsula renal hasta que se alcance el extremo distal (~ 2 mm), hasta el punto en que la aguja sea visible, pero no atraviese el lado craneal de la cápsula renal. Deje que el asistente sumerja la jeringa.
11. Vuelva a colocar el riñón, junto con la grasa expuesta, en el peritoneo. Coloque una sutura reabsorbible (tamaño 4) y cierre la incisión superficial con un pegamento veterinario.
12. En el postoperatorio, administrar una dosis del fármaco analgésico, 25 μL de buprenorfina de liberación sostenida (1 mg/mL) mediante inyección subcutánea (1 mg/kg).
13. Compruebe que los ratones comiencen a recuperarse dentro de los 5 minutos posteriores a la operación.
14. Entre jaulas, cambie los guantes y esterilice los instrumentos en un esterilizador de perlas de vidrio.
15. De 1 a 3 h después de la cirugía, inyecte 100 μL de células CD34⁺ humanas (aproximadamente 100.000 células) en el ratón mediante inyección intravenosa (IV).
16. Realice un chequeo general de la salud de los ratones después de concluir la cirugía (generalmente 2 horas después de la primera jaula), luego 24 horas y 48 horas después.
17. Si hay alguna anormalidad en la disposición o los signos vitales, controle más a fondo a los ratones. Una vez que hayan pasado esos puntos de control, monitoree a los ratones de manera menos estricta (2x-3x por semana).
18. Una semana después de la cirugía, inyecte (IV) a los ratones 100 μL de citocina humana AAV8 (IL-3, IL-7 y GM-CSF; 2 x 10⁹ copias del genoma/mL).
19. Dos semanas después de la cirugía, realice inyecciones IM del plásmido DNA Combo II.
    1. Utilice una máquina de electroporación para realizar inyecciones IM de ADN plasmídico Combo II: SCF, FLT3, CKIT y THPO. Para cada ratón, combine 25 μL de SCF (2 mg/mL), 25 μL de THPO (2 mg/mL), 25 μL de FLT3 (2 mg/mL) y 25 μL de CKIT (10 mg/mL).
    2. Realizar una inyección por pata trasera, es decir, dos en total, con 50 μL por pata, seguida de electroporación en cada lugar de inyección.

Después de una cirugía exitosa y las inyecciones postoperatorias adecuadas, la diferenciación de CD34⁺ se puede confirmar mediante citometría de flujo. Aproximadamente 8 semanas después de la cirugía, los ratones se desangran en preparación para el FACS, que se repite cada 2 semanas hasta que se alcanza un umbral específico de células inmunitarias humanas, como se describió anteriormente¹⁰. En resumen, se recolectaron 100 mL de sangre en tubos...

En este manuscrito se describe la generación de ratones humanizados mediante timo fetal humano injertado bajo la cápsula renal y la posterior inyección de CD34⁺ para recrear un sistema inmunitario humano.

Si bien el protocolo funciona para crear el mejor modelo posible, ciertos pasos son esenciales para la viabilidad. Por ejemplo, durante el aislamiento de CD34⁺ , es esencial que alguien que mire a través del microscopio pueda identif...

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos con este manuscrito.

Gracias a Wistar Flow-Cytometry, Molecular Screening, Vector Core y Animal Facility por su apoyo. Este trabajo fue posible gracias al apoyo de la Fundación de Investigación Médica Dra. Miriam y Sheldon G. Adelson.