Herstellung einer humanisierten Maus durch Thymus-Nierenkapseltransplantation, Injektion von CD34⁺ -Zellen und Zytokinabgabe

Humanisierte Mausmodelle bieten eine genauere Darstellung der Mikroumgebung des menschlichen Immunsystems. Dieses Manuskript beschreibt den Prozess, bei dem diese Modelle durch ein Nierentransplantat aus menschlichem Thymus, die Injektion menschlicher CD34⁺ -Zellen und die gezielte Verabreichung von humanen Zytokin-Transgenen erstellt werden, um die Proliferation und Differenzierung von CD34⁺ -Zellen zu fördern.

Tiermodelle stellen eine wichtige Translation zwischen in vitro und in vivo biomedizinischer Forschung dar. Humanisierte Mausmodelle stellen eine Brücke in der Darstellung menschlicher Systeme dar und ermöglichen so eine genauere Untersuchung von Pathogenese, Biomarkern und vielen anderen wissenschaftlichen Fragestellungen. Bei dieser beschriebenen Methode wird immundefizienten NOD-scid IL2Rγnull (NSG)-Mäusen autologe Thymus implantiert, aus der Leber stammende CD34⁺ -Zellen injiziert, gefolgt von einer Reihe von injizierten Zytokinabgaben. Im Gegensatz zu anderen Modellen ähnlicher Art fördert das hier beschriebene Modell eine verbesserte Rekonstitution von Immunzellen, indem es Zytokine und Wachstumsfaktoren über Transgene abgibt, die in AAV8- oder pMV101-DNA-basierten Vektoren kodiert sind. Darüber hinaus bietet es Langzeitstabilität mit rekonstituierten Mäusen, die eine durchschnittliche Lebensdauer von 30 Wochen nach CD34⁺ -Injektionen haben. Wir hoffen, durch dieses Modell eine stabile und wirkungsvolle Methode zur Untersuchung von Immuntherapie und menschlichen Krankheiten in einem Mausmodell bereitzustellen und damit den Bedarf an präklinischen Modellen zu demonstrieren.

Während Tiermodelle ein tieferes Verständnis von zellulären und molekularen Systemen geschaffen haben, besteht die Herausforderung nach wie vor darin, die Feinheiten artspezifischer Systeme wie Immunität, Physiologie und andere Bereiche der Pathologie aufzuklären. Nicht-menschliche Primaten (NHP), wie z. B. Schimpansen, wurden in der Vergangenheit eingesetzt, um die fehlenden Lücken in der Modellforschung auszugleichen; Das NHP-Modell kann jedoch recht kostspielig und unzugänglich sein, zumal ihre Verwendung in Europa¹ verboten wurde.

Nach einer erfolgreichen Transplantation repliziert das murine System das menschliche Immunsystem, wie die Wiederbesiedlung der lymphatischen Organe zeigt. Die Entwicklung von Mäusen mit funktionierendem menschlichen Immunsystem bietet die Möglichkeit, translationale Forschung zur menschlichen Immunität in einer Vielzahl von Kontexten durchzuführen. Immundefiziente Mäuse, die mit menschlichen Zellen und Geweben transplantiert wurden, die ein operatives menschliches Immunsystem erfolgreich replizieren können, erleichtern die Erforschung von Hämatopoese, Immunität, Gentherapie², Infektionskrankheiten³, Krebs⁴ und regenerativer Medizin⁵. Unsere Gruppe und einige unserer Mitarbeiter haben Ergebnisse mit diesem Modell veröffentlicht, das präklinische Modelle des kutanen Melanoms^{demonstriert 6}. Dieses Modell ist vielseitig genug, um über die Melanom- und Immuntherapieforschung hinaus auf unzählige Bereiche angewendet zu werden.

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) werden häufig für die Humanisierung verwendet, da sie zu einer robusten Rekonstitution von T-Zellen führen, die eine etablierte Rolle bei der Immuntoleranz spielen. Aufgrund ihrer geringen Selbsterneuerungsrate und ihrer hohen Rate an reifen Zellen, die an die Abstammungslinie gebunden sind, werden PBMCs jedoch häufig durch humane Stammzellen (HSC)-basierte Produkte ersetzt, die aus der fetalen Leber gewonnen werden^{können 7}. In Kombination mit diesen abgeleiteten HSC-Produkten entsteht durch die Implantation des menschlichen Thymus unter die Nierenkapseln von NSG-Mäusen ein System, das in der Lage ist, die Entwicklung menschlicher T-Zellen zu unterstützen. Dieses Modell, das als Knochenmark-Leber-Thymus (BLT) bekannt ist, ist sehr vorteilhaft, da es eine mehrlinienige Hämatopoese, eine T-Zell-Bildung im autologen Thymus und eine HLA-Restriktion ermöglicht⁸.

Das in diesem Manuskript vorgeschlagene Modell ist ein modifiziertes BLT-Modell mit zusätzlicher Zytokinabgabe. Es wurde gezeigt, dass proinflammatorische Zytokine die Fähigkeiten von Effektor-Immunzellen stärken, insbesondere durch IL-15-basierte Immuntherapien⁹. CD45⁺ -Lymphozyten werden im peripheren Blut humanisierter Mäuse (Hu-Mäuse) etwa 8-12 Wochen nach der Injektion von humanen CD34⁺ -Zellen beobachtet, was einen deutlichen Anstieg der Rekonstitution im Vergleich zum zirkulierenden Blut regulärer NSG-Mäuse zeigt. Unter Verwendung des Adeno-assoziierten Vektors zur Verabreichung von humanem IL-3, IL-7 und GM-CSF stiegen die Spiegel menschlicher CD45⁺ -Zellen im Umlauf im Vergleich zu Mäusen an, die die Zytokine nicht erhielten. Die Zugabe der DNA-Combo-II-Zytokine (SCF, FLT3, CKIT und THPO) verbessert die Differenzierung von T-Zellen und myeloischen Zellen¹⁰. Die Hinzufügung einer Zytokinabgabe unterscheidet diese Methode von den anderen Hu-Mäusemodellen, wie durch veröffentlichte Daten gestützt^{wird 10}.

Die Entwicklung dieses Modells mit einer angeborenen und adaptiven menschlichen Immunantwort hat es ermöglicht, Daten zur Therapieresistenz und zur Tumormikroumgebung zu veröffentlichen¹⁰. Vorausgesetzt, Laboratorien können auf Gewebeproben zugreifen, um diese Methode anzuwenden; Dieses Hu-Mäuse-Modell hat ein großes Potenzial für andere Labore, ähnliche Bereiche zu untersuchen und in andere Bereiche der Immuntherapie und präklinische Studien zu expandieren.

Alle Protokolle, bei denen Tiere verwendet werden, werden vom Institutional Animal Care and User Committee (IACUC) des Wistar-Instituts genau überwacht. Das Labor hält sich an die Richtlinien, die von diesem Ausschuss und dem behandelnden Tierarzt festgelegt wurden, um die Gesundheit, Sicherheit und das Wohlbefinden der beteiligten Tiere zu gewährleisten. Vor der Befolgung dieses Protokolls ist die Genehmigung des Tierarztes und der IACUC erforderlich, und es kann zu Abweichungen in den spezifischen Operationstechniken und im Umgang mit den Tieren im Vergleich zum Protokoll kommen, je nach Anraten der oben genannten Parteien, die am Tierschutz beteiligt sind.

HINWEIS: Gewebeproben können bis zur Verwendung eingefroren werden. Darüber hinaus kann die CD34⁺ -Isolierung am selben Tag oder am folgenden Tag wie die Nierentransplantation durchgeführt werden. Diese Informationen geben Aufschluss darüber, wann Busulfan injiziert wird: Wenn Sie beabsichtigen, eine Operation am selben Tag wie die Isolierung durchzuführen, sollte Busulfan präventiv injiziert werden, um das Aufnahmegewebe vorzubereiten. Behandlung von dreißig weiblichen 5-7 Wochen alten NSG-Mäusen mit 30 mg/kg (100 μl, PBS 1x) eines frisch hergestellten myelo-abbauenden Medikaments; Busulfan injizierte IP 24 Stunden vor der Operation.

1. Isolierung von CD34⁺ -Zellen

1. Bereiten Sie die Aufschlusslösung vor, indem Sie 100 mg Kollagenase/Dispase in 50 ml RPMI1640 auflösen. Verwenden Sie einen 0,22 μm Vakuumfilter, um die Aufschlusslösung zu sterilisieren.
2. Die fetale Leber (>Alter von 20 Wochen) wird in 50 ml RPMI1640 Medium bereitgestellt. Aspirieren und verwerfen Sie das Medium, wobei 10 ml in dem Röhrchen verbleiben, das die Leber enthält.
3. Waschen Sie das Tuch zweimal mit 45 ml RPMI1640 + 100 μg/ml des Antibiotikums Primocin in einem konischen 50-ml-Röhrchen und saugen Sie das Medium zwischen jedem Waschen ab. Achten Sie darauf, dass sich das Gewebe am Boden des Röhrchens absetzt, bevor Sie das Medium absaugen.
4. Legen Sie ein steriles Gewebesieb in ein steriles 200-ml-Becherglas.
5. Gießen Sie die fetale Leber durch das Sieb und verwenden Sie das Ende einer sterilen 10-ml-Plastikspritze, um das Gewebe zu zerkleinern.
6. Spülen Sie die im Sieb verbleibenden Leberzellen mit 50 ml RPMI1640 + 100 μg/ml des Antibiotikums Primocin, gefolgt von 50 ml RPMI1640 Kollagenase/Dispase-Medium (2 mg/ml). Das 200-ml-Becherglas enthält nun das RPMI1640 mit Primocin, RPMI1640 Kollagenase/Dispase und homogenisierter Leber.
7. Die Mischung wird in vier konische 50-ml-Röhrchen aliquotiert und 1 h lang in einem Wasserbad (37 °C) inkubiert. Schütteln Sie die konischen Röhrchen alle 15 Minuten.
8. Geben Sie 15 ml Ficoll in vier konische 50-ml-Röhrchen hinein.
9. Schichten Sie die homogenisierte Leberlösung vorsichtig darauf und verteilen Sie ca. 35 ml auf jedes Röhrchen. Stören Sie die Benutzeroberfläche nicht.
10. Legen Sie die Röhrchen in die Zentrifuge und drehen Sie sie 1 h lang bei 800 x g mit minimaler Beschleunigung/Bremse.
11. Nehmen Sie die Röhrchen aus der Zentrifuge und sammeln Sie die Zellen von der Grenzfläche (10-15 mL) in zwei konische 50-ml-Röhrchen.
12. Geben Sie PBS 1x bis zu 50 mL hinzu, um das Pellet zu waschen, und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
13. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysepuffer und inkubieren Sie es 5-10 Minuten lang. Füllen Sie die Tube mit 1x PBS.
14. Zählen Sie die Zellen manuell unter dem Mikroskop mit Trypanblau und einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min.
    HINWEIS: Die mononukleären Leberzellen können auf Wunsch direkt von hier injiziert werden, z. B. wenn die Zellzahl weniger als 50 Millionen Zellen beträgt.
15. Vakuumieren Sie das PBS ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μl des Trennpuffers (2 mM EDTA, 5 μg/mL BSA in 1x PBS) für 100 x 10⁶ Zellen oder weniger. Verwenden Sie für mehr als 100 x 10⁶ Zellen ein Verhältnis, das auf der obigen Anzahl von Zellen basiert, um die Puffermenge zu bestimmen (d. h. verdoppeln Sie die Zellen, verdoppeln Sie den Puffer).
16. 100 μl FcR-Blockierungsreagenz zugeben und 2-5 Minuten inkubieren.
17. 100 μl CD34-Mikrokügelchen-Antikörper zugeben, gut mischen und 30 Minuten auf Eis inkubieren; Nach 15 min mechanisch mit der Hand schütteln.
18. Fügen Sie 7-10 ml des Trennpuffers hinzu und filtrieren Sie in dieser Reihenfolge durch 100 μm-, 70 μm- und 40 μm-Zellsiebe.
19. Platzieren Sie ein spaltenbasiertes Zelltrennzeichen in einem magnetischen Trennzeichen. Legen Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen unter den Separator, um den Durchfluss und den Puffer aufzufangen.
20. Füllen Sie die Säule mit 500 μL des Trennpuffers.
21. Gießen Sie die Zellsuspension durch die Säule.
22. Füllen Sie die Säule mit dem Durchfluss und dem Puffer, die in dem konischen Rohr gesammelt wurden.
23. Waschen Sie die Säule 3 Mal mit 500 μL des Trennpuffers.
24. Entsorgen Sie den Durchfluss und ersetzen Sie das Röhrchen durch ein 15-ml-Polystyrolröhrchen.
25. Füllen Sie die Säule mit 1 mL des Trennpuffers, nehmen Sie die Säule vom Magneten und spülen Sie den Kolben mit einem Druck nach unten.
26. Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in 1x PBS zur Injektion. Bis zur Verwendung auf Eis legen.

2. Verarbeitung des Thymus

1. Waschen Sie den autologen Thymus (>Alter von 20 Wochen) durch Zugabe von 5-8 ml RPMI1640 und lassen Sie das Gewebe absetzen. Entfernen Sie das Medium vorsichtig durch Vakuum und vermeiden Sie dabei den Kontakt mit dem Thymus. Wiederholen Sie dies noch einmal.
2. In 10 ml Raumtemperatur RPMI1640 mit Primocin (100 μg/ml) suspendieren.
3. Übertragen Sie den Thymus in eine gewebebehandelte Petrischale. Stellen Sie sicher, dass der Thymus vollständig mit Primocin-media bedeckt ist.
4. 30-45 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Saugen Sie das Primocin-Medium ab. Waschen Sie den Thymus mit 5-8 ml RPMI1640, entfernen Sie das Medium durch Vakuumieren und wiederholen Sie dies noch einmal.
6. Suspendieren Sie den Thymus in 5-8 ml RPMI1640.
7. Bereiten Sie den inkubierten Thymus für die Transplantation vor, indem Sie mit zwei Skalpellen 1 mm x 2 mm große Segmente aufschneiden.
   HINWEIS: Diese wird in die Mäuse eingepfropft; Stellen Sie daher sicher, dass die Thymusscheiben sowohl in die Spritze als auch aus der Spritze und der beigefügten 22-G-Hamilton-Nadel relativ einfach vakuumiert werden können.

3. Subrenale Kapseltransplantation und Injektion von CD34-Zellen

1. Untersuchen Sie die Mäuse vor der Operation auf ihren allgemeinen Gesundheitszustand. Rasieren Sie die Mäuse, um einen Bereich (ca. 3" x 2") am linken Seitenkörper freizulegen.
2. Betäuben Sie die Mäuse über Isofluran (Induktion 5%, Erhaltungstherapie 2%-3%) in der Kammer und überführen Sie dann einzelne Mäuse aus der Kammer in ein chirurgisches Stadium mit einem Nasenkonus.
3. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit Chlorhexidin und Alkoholvorbereitungstäbchen. Stellen Sie eine individuelle Betäubung per Pinch-Test sicher.
4. Machen Sie einen großen Schnitt (5-7 mm) nach hinten, lateral der Wirbelsäule der Maus, und falten Sie die Haut zurück.
5. Achten Sie darauf, dass an dieser Stelle die Milz unter der Faszie sichtbar ist. Machen Sie einen kleineren Schnitt von ~2 mm in der Faszie. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt so klein wie möglich ist, während die Niere vollständig freigelegt wird.
6. Bestimmen Sie die Stelle dieses Schnitts, indem Sie die Milz visuell identifizieren und sie als Marker für die Niere verwenden, die nicht sichtbar ist.
   HINWEIS: Die murine Niere befindet sich hinter einer Fettgruppe im nordöstlichen Quadranten zur Milz.
7. Positionieren Sie von hier aus die Hand (den Chirurgen) unter der Seite der Maus gegenüber dem Schnitt und drücken Sie, um die Niere freizulegen. Positionieren Sie das Fett neu, um die Niere vollständig freizulegen.
8. Verwenden Sie die Finger derselben Hand, um die freiliegende Niere zu stabilisieren. Verwenden Sie bei Bedarf steriles 1x PBS, um die freiliegende Niere zu schmieren.
   HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass der Chirurg andere Finger verwenden muss als diejenigen, die die Seite der Maus berührt haben, um die Niere zu halten und die Sterilität zu erhalten. Sprechen Sie mit dem Tierarzt des Instituts über die richtige Aufrechterhaltung der Sterilität.
9. Lassen Sie den Assistenten gleichzeitig eine stumpfe Spritze mit dem fötalen Thymusgewebe vorbereiten. Saugen Sie 2-3 mittelgroße Thymusbrocken (1 mm x 2 mm) vorsichtig mit minimalem Medium bis zur Nadelspitze auf und übergeben Sie sie dann dem Chirurgen, um den Eingriff durchzuführen.
   HINWEIS: Die Anzahl der Thymusbrocken hängt von der Größe des Gewebes ab, normalerweise reichen 2 Brocken aus, um vermenschlichte Mäuse zu erhalten.
10. Lassen Sie den Chirurgen die Nadel durch das kaudale Ende der Nierenkapsel einführen, bis das distale Ende erreicht ist (~2 mm), bis zu dem Punkt, an dem die Nadel sichtbar ist, aber nicht durch die Schädelseite der Nierenkapsel bricht. Lassen Sie den Assistenten die Spritze eintauchen.
11. Legen Sie die Niere zusammen mit dem freiliegenden Fett wieder in das Bauchfell. Legen Sie eine resorbierbare Naht (Größe 4) an und verschließen Sie den oberflächlichen Schnitt mit einem Tierkleber.
12. Postoperativ ist eine Dosis des Analgetikums, 25 μl Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung (1 mg/ml) durch subkutane Injektion (1 mg/kg) zu verabreichen.
13. Vergewissern Sie sich, dass sich die Mäuse innerhalb von 5 Minuten nach der Operation zu erholen beginnen.
14. Wechseln Sie zwischen den Käfigen die Handschuhe und sterilisieren Sie die Instrumente in einem Glasperlensterilisator.
15. 1-3 Stunden nach der Operation injizieren Sie der Maus 100 μl humane CD34⁺ -Zellen (ca. 100.000 Zellen) durch intravenöse (IV) Injektion.
16. Führen Sie nach Abschluss der Operation einen allgemeinen Gesundheitscheck an den Mäusen durch (in der Regel 2 Stunden nach dem ersten Käfig), danach 24 Stunden und 48 Stunden.
17. Wenn es Anomalien in der Disposition oder den Vitalfunktionen gibt, überwachen Sie die Mäuse weiter. Sobald sie diese Kontrollpunkte passiert haben, überwachen Sie die Mäuse weniger streng (2x-3x pro Woche).
18. Eine Woche nach der Operation injizieren Sie den Mäusen 100 μl AAV8 humanes Zytokin (IL-3, IL-7 und GM-CSF; 2 x 10⁹ Genomkopien/ml).
19. Führen Sie zwei Wochen nach der Operation IM-Injektionen des Plasmids DNA Combo II durch.
    1. Verwenden Sie ein Elektroporationsgerät, um IM-Injektionen von Plasmid-DNA-Combo II durchzuführen: SCF, FLT3, CKIT und THPO. Kombinieren Sie für jede Maus 25 μl SCF (2 mg/ml), 25 μl THPO (2 mg/ml), 25 μl FLT3 (2 mg/ml) und 25 μl CKIT (10 mg/ml).
    2. Führen Sie eine Injektion pro Hinterbein durch, d. h. insgesamt zwei mit 50 μl pro Bein, gefolgt von einer Elektroporation an jeder Injektionsstelle.

Nach erfolgreicher Operation und entsprechenden postoperativen Injektionen kann die CD34⁺ -Differenzierung mittels Durchflusszytometrie bestätigt werden. Etwa 8 Wochen nach der Operation werden die Mäuse zur Vorbereitung auf das FACS bluten und alle 2 Wochen wiederkehrend, bis ein spezifischer Schwellenwert an menschlichen Immunzellen erreicht ist, wie zuvor beschrieben¹⁰. Kurz gesagt wurden 100 ml Blut in Blutentnahmeröhrchen gesammelt, die mit Lith...

Dieses Manuskript hat hierin die Erzeugung humanisierter Mäuse durch humanen fötalen Thymus, der unter die Nierenkapsel transplantiert wurde, und die anschließende CD34⁺ -Injektion beschrieben, um ein menschliches Immunsystem wiederherzustellen.

Während das Protokoll dazu dient, das bestmögliche Modell zu erstellen, sind bestimmte Schritte für die Rentabilität unerlässlich. Zum Beispiel ist es während der CD34⁺ -Isolierung unerl?...

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen mit diesem Manuskript.

Vielen Dank an Wistar Flow-Cytometry, Molecular Screening, Vector Core und Animal Facility für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde mit Unterstützung der Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation ermöglicht.